Viêm phổi không điển hình và ứng dụng kỹ thuật Real-time PCR trong phát hiện bệnh

Viêm phổi không điển hình là tình trạng nhiễm trùng phổi do nhóm vi khuẩn gồm Legionella pneumophila, Mycoplasma pneumoniae và Chlamydophila pneumoniae gây ra. Triệu chứng bệnh thường nhẹ  so với  các loại viêm phổi khác và thậm chí người bệnh không biết họ đang bị viêm phổi. Tuy nhiên, bệnh nhân không nên chủ quan, và cần theo dõi các dấu hiệu bệnh, nếu có các biến chứng cần được phát hiện và điều trị kịp thời. 

Chuẩn bị những hiểu biết về bệnh viêm phổi không điển hình gây ra; triệu chứng, biểu hiện và các phát hiện bệnh,…. sẽ được chúng tôi đề cập trong bài viết lần này. Hãy tham khảo bài viết bên dưới đây nhé! 

Bệnh viêm phổi không điển hình

Viêm phổi không điển hình gây ra chủ yếu bởi 3 chủng vi khuẩn gồm: 

• Mycoplasma pneumoniae: Chiếm từ 55 – 70% trường hợp, thuộc lớp Mollicutes, kích thước nhỏ 0.15-0.3 µm; không có vách tế bào; không quan sát được dưới kính hiển vi thông thường. 
• Chlamydia pneumoniae: Chiếm từ 10 – 15% trường hợp, thuộc họ vi khuẩn Chlamydia, vi khuẩn Gram âm, kích thước nhỏ 0.2 – 1 µm.
• Legionella pneumoniae: Chiếm từ 5 – 7% trường hợp, là vi khuẩn Gram âm, dạng trực khuẩn hoặc dạng sợi; kích thước 0,3 – 0,9 µm x 2 – 20 µm; có khả năng di động, không sinh nha bào và không có vỏ. 

 

 

 

 

 

 

 

Hình 1. Hình ảnh 3D vi khuẩn gây bệnh viêm phổi không điển hình từ trái sang phải (Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae và Legionella pneumoniae)

Bệnh viêm phổi không điển hình xuất hiện lần đầu tiên vào năm 1938 và có xu hướng ngày một gia tăng. Tỷ lệ viêm phổi không điển hình chiếm khoảng 15 – 25% trong tổng số các trường hợp viêm phổi nói chung. Bất cứ lứa tuổi nào cũng có thể mắc bệnh do nhiễm vi khuẩn; tuy nhiên độ tuổi tuổi thường gặp nhất là trẻ em từ 2 – 10 tuổi hoặc người lớn dưới 40 tuổi, trong đó độ tuổi tiền học đường chiếm tới 75 – 80%.

Triệu chứng bệnh viêm phổi không điển hình thường nhẹ tác nhân lây nhiễm là vi khuẩn Mycoplasma pneumoniae và Chlamydia pneumoniae. Triệu chứng có thể nặng hơn, nhất là trong 4-6 ngày đầu tiên, sau đó cải thiện trong 4-5 ngày khi mắc bệnh do vi khuẩn Legionella pneumoniae gây ra. Bên cạnh đó, bệnh nhân gặp một số triệu chứng thông thường bao gồm:

• Cảm thấy ớn lạnh
• Ho (nếu bị viêm phổi do vi khuẩn legionella, bạn có thể ho ra chất nhầy lẫn máu)
• Sốt (có thể nhẹ hoặc cao)
• Thở gấp (xuất hiện khi gắng sức làm một việc gì đó).

Nhìn chung, các triệu chứng thực thể của viêm phổi không điển hình khá nghèo nàn. Việc thăm khám thường ít có biểu hiện rõ ràng như ở phổi hay các triệu chứng khác. 

Giải pháp phát hiện bệnh bằng kỹ thuật Real-time PCR

AccuPid Pneumonia 3 Detection Kit của hãng sản xuất Khoa Thương, được sử dụng trong xét nghiệm phát hiện vi khuẩn Mycoplasma pneumonia (M.P), Chlamydophila (Chlamydia) pneumoniae (C.P), Legionella pneumophila (L.P) gây bệnh viêm phổi không điển hình, áp dụng trên các nền mẫu từ các bệnh phẩm dịch tiết hô hấp (dịch phết tỵ hầu, dịch phết mũi hầu, dịch phế quản phế nang, phết tai mũi họng, mẫu đàm, dịch nội khí quản, dịch màng phổi,…) hoặc các loại bệnh phẩm khác cần xét nghiệm M. pneumoniae, C. pneumonia, L. pneumophila. Kit có ưu điểm là dễ thực hiện, độ đặc hiệu, độ nhạy cao; có chứng nội ngoại sinh và các đối chứng khác để kiểm soát khả năng dương tính giả, âm tính giả.

Quy trình thực hiện gồm 4 bước cơ bản như:

Bước 1: Chuẩn bị mẫu  (dịch tiết hô hấp) 

Bước 2: Tách chiết DNA

Bước 3: Nhân bản vùng trình tự mục tiêu bằng hệ mồi đặc hiệu và thu nhận tín hiệu huỳnh quang bằng thiết bị real-time PCR.

Bước 4: Phân tích kết quả

Quá trình có thể hoàn tất trong khoảng 3 – 4 giờ.

Chuẩn bị mẫu

Dịch tiết hô hấp: dịch phết tỵ hầu, dịch phết mũi hầu, dịch phế quản phế nang, phết tai mũi họng, mẫu đàm, dịch nội khí quản, dịch màng phổi,…

Tách chiết DNA

DNA trong mẫu bệnh phẩm được tách chiết và tinh sạch nhằm loại bỏ các chất gây ức chế phản ứng PCR. Các phương pháp tách chiết DNA thường bao gồm bước biến tính protein; cố định DNA và rửa trôi các chất ức chế; và thu nhận DNA tinh sạch. Các chất gây biến tính protein sẽ phá vỡ cấu trúc các protein trên tế bào người và vi khuẩn, virus, nấm,…từ đó làm vỡ tế bào và giải phóng DNA bộ gen. Sau đó, DNA được giữ lại trên các giá thể phù hợp và loại bỏ chất gây ức chế bằng các dung dịch rửa giải. Cuối cùng, DNA tinh sạch được thu hồi bằng cách hòa tan DNA trong dung dịch bảo quản.

Nhân bản và phát hiện

Phản ứng PCR

Đầu tiên, nhiệt độ phản ứng được nâng cao làm các phân tử DNA bị biến tính thành dạng mạch đơn và hoạt hóa enzyme Taq DNA polymerase. Khi ống phản ứng được làm mát, các đoạn mồi đến bắt cặp với vùng gen mục tiêu. Nhờ có sự hiện diện của ion Mg2+ và các deoxynucleotide triphosphate (dNTP) ở nồng độ cao, Taq DNA polymerase sẽ kéo dài mồi để tạo nên các phân tử DNA mạch đôi gọi là amplicon. Việc tăng và giảm nhiệt độ của phản ứng được máy luân nhiệt lặp lại theo số chu kỳ đã định trước. 

Phát hiện sản phẩm

Với việc sử dụng mẫu dò đánh dấu huỳnh quang (mẫu dò Taqman), sự gia tăng số lượng sản phẩm PCR có thể được theo dõi theo thời gian thực (real-time) bằng cách đo mật độ tín hiệu huỳnh quang phát ra trong suốt quá trình PCR. Khi mẫu dò vẫn còn nguyên vẹn, tín hiệu huỳnh quang phát ra bởi reporter sẽ bị quencher thu hút. Khi phản ứng PCR xảy ra, mẫu dò bắt cặp với vùng gen mục tiêu nằm giữa 2 mồi và bị phân cắt bởi hoạt tính 5’ – 3’ exonuclease của Taq DNA polymerase. Lúc này, phân tử reporter và quencher được tách nhau ra và tín hiệu huỳnh quang thu được từ reporter trở nên mạnh hơn. 

Phân tích kết quả

Sự có mặt hay vắng mặt của DNA mục tiêu được xác định dựa trên sự có hay không có sản phẩm PCR thông qua việc quan sát tín hiệu huỳnh quang trên thiết bị.

Tóm lại, bệnh viêm phổi không điển hình là dạng bệnh viêm phổi thường gặp, không quá nghiêm trọng đối với bệnh nhân. Tuy nhiên, bệnh cần được phát hiện sớm điều trị sớm tránh những biến chứng vô cùng nguy hiểm. 

Nguồn: Tổng hợp