Phát hiện vi khuẩn Salmonella spp. trong thực phẩm bằng kỹ thuật real-time PCR

Vai trò của việc phát hiện vi khuẩn Salmonella spp. trong thực phẩm

Vi khuẩn gây bệnh cho người phân bố rất phổ biến trong môi trường giàu dinh dưỡng, đặc biệt là thực phẩm. Việc sử dụng các thực phẩm nhiễm vi khuẩn là một trong những nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm. 

Salmonella spp. là loài vi khuẩn có thể sống trong các ống ruột của người và động vật khác, gây ra bệnh Salmonellosis. Người bị bệnh Salmonellosis thường bị nhức đầu, sốt, co thắt dạ dày, tiêu chảy, buồn nôn và ói. Bất cứ ai cũng có thể nhiễm vi khuẩn Salmonella. Ở Úc, hầu hết các trường hợp bệnh Salmonellosis đều xảy ra sau khi ăn thức ăn có nhiễm vi khuẩn Salmonella, thường là các thực phẩm nấu không kỹ có nguồn gốc từ động vật bị nhiễm khuẩn.

Bên cạnh ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng cuộc sống của người dân thì các thực phẩm nhiễm khuẩn này còn gián tiếp làm giảm nguồn lợi kinh tế do không thể xuất khẩu những sản phẩm thực phẩm nhiễm vi sinh vật ra nước ngoài, đặc biệt là thủy sản.

Do đó, cần chủ động kiểm soát chất lượng và đánh giá độ an toàn thực phẩm để đảm bảo sức khỏe cũng như các lợi ích về kinh tế, nâng cao uy tín của các doanh nghiệp kinh doanh xuất khẩu thực phẩm. 

Phương pháp phát hiện vi khuẩn Salmonella spp. trong thực phẩm 

Hiện nay, việc phát hiện các vi khuẩn Salmonella spp. trong thực phẩm chủ yếu được thực hiện bằng các phương pháp nuôi cấy truyền thống. Nhưng bên cạnh đó, phương pháp phát hiện bằng kỹ thuật PCR/real-time PCR cũng đang được ứng dụng phổ biến bởi ưu điểm về thời gian xét nghiệm và độ nhạy, độ đặc hiệu cao.

AccuPid Salmonella spp. Detection Kit của hãng sản xuất Khoa Thương – Việt Nam là một bộ kit được ứng dụng kỹ thuật real-time PCR để phát hiện mẫu thực phẩm bị nhiễm vi khuẩn Salmonella spp. theo chỉ tiêu định tính: có nhiễm hoặc không nhiễm Salmonella spp.. Xét nghiệm này có khả năng ứng dụng trên 5 nền mẫu thực phẩm: Thịt tươi hoặc đông lạnh; Thịt và sản phẩm thịt đã qua xử lý nhiệt; Cá và Thủy sản tươi; Sản phẩm chế biến từ Cá và Thủy sản; Sữa dạng lỏng (Sữa tươi).

Quy trình xét nghiệm vi khuẩn Salmonella spp. trong mẫu thực phẩm hoạt động dựa trên bốn bước chính: 

(1) Chuẩn bị mẫu (bước tăng sinh); 

(2) Tách chiết DNA; 

(3) Nhân bản DNA Salmonella spp. bằng hệ mồi đặc hiệu và thu nhận tín hiệu huỳnh quang bằng thiết bị real-time PCR; 

(4) Phân tích kết quả. 

Toàn bộ quy trình thực hiện trong khoảng 30 giờ.

Chuẩn bị mẫu (tăng sinh)

Cung cấp môi trường và điều kiện nuôi cấy thuận lợi cho sự phát triển của Salmonella spp. nhằm gia tăng số lượng (nếu có) của chúng trong mẫu lên nhiều lần.

Tách chiết DNA

DNA của vi khuẩn Salmonella spp. được tách chiết từ dịch tăng sinh bằng phương pháp nhiệt (có thể sử dụng kit tách chiết AccuRive Bacteria DNA Prep Kit (EX-DNA04.2A) của hãng Khoa Thương). DNA vi khuẩn có trong mẫu được thu nhận bằng phương pháp nhiệt. Quá trình đun sôi kết hợp lắc trộn sẽ tạo sự phá vỡ cơ học lên cấu trúc protein của màng tế bào và giải phóng DNA. DNA sau khi được giải phóng sẽ di chuyển vào pha nước và được sử dụng cho phản ứng PCR.

Phản ứng real-time PCR

DNA sau khi được tách chiết sẽ được bổ sung vào tube PCR chứa hỗn hợp các thành phần của phản ứng PCR. Hỗn hợp phản ứng PCR chứa một cặp mồi nhân bản một phần đoạn gene invA có vai trò trong việc xâm nhiễm tế bào biểu mô, đã được chứng minh hiện diện phổ biến trên 245 chủng Salmonella. Sản phẩm nhân bản được phát hiện bởi tín hiệu huỳnh quang có được do sự phân cắt mẫu dò TaqMan đánh dấu màu FAM đặc hiệu cho Salmonella spp.. Và một “chứng nội kiểm soát sự nhân bản” (Internal Amplification Control – IAC) là đoạn DNA nhân tạo để phát hiện các chất ức chế có trong mẫu và kiểm soát hiệu quả nhân bản của phản ứng PCR, được thiết kế có chứa vùng trình tự mẫu dò phát huỳnh quang màu HEX. 

Đầu tiên, nhiệt độ phản ứng được nâng cao làm các phân tử DNA bị biến tính thành dạng mạch đơn. Ngoài ra, enzyme Taq DNA polymerase lúc này cũng được hoạt hóa. Khi ống phản ứng được làm mát, các đoạn mồi đến bắt cặp với vùng gen mục tiêu. Nhờ có sự hiện diện của ion Mg2+ và các deoxynucleotide triphosphate (dNTP) ở nồng độ cao, Taq DNA polymerase sẽ kéo dài mồi để tạo nên các phân tử DNA mạch đôi gọi là amplicon. Việc tăng và giảm nhiệt độ của phản ứng được máy luân nhiệt lặp lại theo số chu kỳ đã định trước. Hiện tượng nhân bản chỉ xảy ra ở vùng gen mục tiêu chứ không xảy ra trên toàn bộ bộ gen.

Khi trong mẫu có DNA mục tiêu, phản ứng PCR xảy ra, mẫu dò bắt cặp với vùng gen mục tiêu nằm giữa 2 mồi và bị phân cắt bởi hoạt tính 5’ – 3’ exonuclease của Taq DNA polymerase. Lúc này, phân tử reporter và quencher được tách nhau ra và tín hiệu huỳnh quang thu được từ reporter trở nên mạnh hơn.

Phân tích kết quả

Sự có mặt hay vắng mặt của DNA mục tiêu được xác định dựa trên sự có hay không có sản phẩm PCR thông qua việc quan sát tín hiệu huỳnh quang trên thiết bị.

Tóm lại, thực phẩm nhiễm vi khuẩn là một trong những nguyên nhân chính gây ngộ độc thực phẩm với hậu quả nặng nề. Do đó, kiểm soát chất lượng và đánh giá độ an toàn thực phẩm là việc làm quan trọng cần thiết để đảm bảo sức khỏe cho người sử dụng nói riêng cũng như  nâng cao uy tín của các doanh nghiệp kinh doanh xuất khẩu thực phẩm nói chung. 

Mọi thông tin về sản phẩm, xin vui lòng liên hệ ngay với chúng tôi:
Công ty TNHH Khoa học NKTBIO
VPGD: Số 60, đường số 13, Khu Dân cư Bình Hưng, Ấp 2, xã Bình Hưng, huyện Bình Chánh, TPHCM.
Hotline: 028.3636.5898
Email: info@nktbioco.com