Các dạng mẫu dò (probes) thường sử dụng trong real-time PCR

Mẫu dò (probes) trong Real-time PCR có thể khác nhau ở kích thước, hình dạng và cấu tạo. Bên cạnh đó, mỗi loại mẫu dò có chất lượng và ưu điểm khác nhau. Có 6 mẫu dò phổ biến thường được sử dụng như:

Mẫu dò thủy giải (Hydrolysis Probes)

Mẫu dò thủy giải thường được gắn chất phát huỳnh quang (reporter) ở đầu 5′ và chất dập tắt tín hiệu huỳnh quang (quencher) ở đầu 3′. Trong quá trình nhân bản, DNA polymerase có hoạt tính 5’-3’ exonuclease thủy giải cắt bỏ probe ở đầu 5′ (reporter); nhờ vậy tín hiệu huỳnh quang phát ra không còn bị quencher hấp thụ, và được thu nhận. Mẫu dò thủy giải có thể được sửa đổi để tăng độ ổn định liên kết hoặc tín hiệu đặc hiệu. Ví dụ, mẫu dò BHQnovaTM tích hợp 2 bộ quencher làm tănng độ dài probe mà không làm tăng độ nhiễu tín hiệu nền. Trong khi mẫu dò BHQplus™ sử dụng nucleotides sửa đổi C và T làm giảm độ dài probe, giúp tăng độ đặc hiệu và phân biệt được hiện tượng bắt cặp lỗi (mismatch) tốt hơn.

Mẫu dò Minor Groove Binders (MGBs)

MGBs liên kết chọn lọc không cộng hóa trị với rãnh nhỏ và nông trong cấu trúc chuỗi xoắn DNA. Mẫu dò Dual-labelled được gắn phân tử MGB, hình thành cầu trúc bền vững với DNA mục tiêu mạch đơn; cho phép mẫu dò có chiều dài ngắn hơn và khả năng dập tắt tín hiệu huỳnh quang vượt trội [1].

Mẫu dò Locked Nucleic Acids (LNAs)

LNAs là các đơn phân RNA biến đổi chứa cầu nối metylen liên kết 2′ oxygen với 4′ carbon trong vòng RNA pentose, giúp cố định cấu trúc của vòng. Khi tích hợp vào mẫu dò, LNAs làm tăng nhiệt độ gắn mồi, cho phép chiều dài mẫu dò ngắn hơn và tăng độ nhạy.

Mẫu dò Molecular Beacons

Molecular beacons chứa vòng loop nhận dạng mục tiêu và 2 bên mẫu dò có hai trình tự ngắn bổ sung lẫn nhau gắn với reporter và quencher. Cấu trúc hình kẹp tóc (stem-loop) làm cho 2 đầu gắn reporter và quencher gần nhau cho đến giai đoạn gắn mồi, cấu trúc này mở vòng và cho phép đầu reporter và quencher cách xa nhau, nên tín hiệu huỳnh quang phát ra được thu nhận [2].

Mẫu dò ScorpionsTM Primers

ScorpionsTM primers sử dụng cấu trục hình kẹp tóc để dập tắt tín hiệu huỳnh quang cho đến giai đoạn gắn mồi. Cấu trúc này liên kết trực tiếp với đầu 5′ của mồi (primer), và được tích hợp một đoạn oligonucleotides khóa ( PCR blocker) giúp ngăn ngừa quá trình tổng hợp mạch bổ sung sai phương hướng. Mẫu dò Scorpions primers mở vòng và gắn (lai) với trình tự mục tiêu mới tổng hợp trong suốt chù kỳ thứ 2 Real-time PCR và những chu kỳ sau đó; cho phép tín hiệu huỳnh quang phát ra được thu nhận.

Mẫu dò FRET Probes

Mẫu dò truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET) bao gồm 2 đoạn oligonucleotides gắn huỳnh quang. Trong quá trình biến tính Real-time PCR, các mẫu dò này gắn (lai) với trình tự mục tiêu, tạo thành 1 cặp gồm donor (chất cho) và acceptor (chất nhận) gần nhau. Ánh sáng kích thích từ chiều donor truyền năng lượng sang acceptor thông qua FRET, cho phép tín hiệu huỳnh quang được thu nhận.

Tài liệu tham khảo

[1]. I.V. Kutyavin et al., “3′-minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures,” Nucleic Acids Res, 28(2):655-61, 2000.

[2]. K. Wang et al., “Molecular engineering of DNA: molecular beacons,” Angew Chem Int Ed Engl, 48(5):856-70, 2009.