Bộ kit phát hiện đồng thời bệnh đốm trắng và bệnh đầu vàng trong một xét nghiệm

Bệnh đốm trắng và bệnh đầu vàng là hai trong những căn bệnh vô cùng nguy hiểm ở tôm, có khả năng gây chết lên tới 90% – 100% trong 3 – 10 ngày nhiễm bệnh. Một trong những nguyên nhân gây bệnh này là do tác nhân virus: virus gây hội chứng đốm trắng (White Spot Syndrome Virus – WSSV) và virus gây hội chứng đầu vàng (Yellow Head Syndrome Virus – YHV1). Hai loại virus này có độc lực rất mạnh, tấn công nhiều mô tế bào khác nhau và có khả năng gây chết ở mọi giai đoạn phát triển của tôm, từ ấu trùng tôm đến tôm giống, tôm trưởng thành. Đối tượng xâm nhiễm chủ yếu của chúng là các loài tôm thuộc họ Penaeidae như P. monodon (tôm sú) và P. vannamei (tôm thẻ chân trắng). Vì vậy, cần tầm soát nguy cơ nhiễm bệnh sớm để có biện pháp xử lý kịp thời, giảm thiểu thiệt hại kinh tế khi nuôi. Trong bài viết lần này, chúng tôi sẽ giới thiệu đến bạn đọc một bộ kit có thể phát hiện đồng thời hai tác nhân gây bệnh đốm trắng và đầu vàng ở tôm bằng kỹ thuật real-time PCR. Cùng theo dõi bên dưới nhé!

——————————————————————————————————————————————————————————————————-

    Accupid WYV Detection Kit sử dụng kỹ thuật Onestep Multiplex Real-time RT-PCR cho phép phát hiện đồng thời DNA của WSSV và RNA của YHV1 một cách nhanh chóng với độ chính xác và độ nhạy cao, đồng thời giảm thiểu các nguy cơ ngoại nhiễm so với các kỹ thuật PCR khác. Xét nghiệm được sử dụng trước và trong suốt quá trình nuôi (tôm bố mẹ, tôm ấu trùng và tôm thương phẩm) thuộc họ Penaeidae.

Nguyên lý hoạt động 

   AccuPid WYV Detection Kit hoạt động dựa trên việc nhân bản trình tự DNA/RNA mục tiêu bằng hệ mồi – mẫu dò đặc hiệu và có thể đọc trực tiếp kết quả dựa trên tín hiệu huỳnh quang thu được mà không cần phải làm thêm bước điện di.

   AccuPid WYV Detection Kit hoạt động dựa trên ba bước chính:

• Bước 1: Xử lý mẫu mô tôm để thu được DNA/RNA virus;
• Bước 2:  Chuyển RNA thành cDNA đồng thời nhân bản DNA/cDNA bằng hệ mồi đặc hiệu và phát hiện đồng thời sản phẩm nhân bản dựa trên tín hiệu huỳnh quang thu được;
• Bước 3: Phân tích kết quả.

Thu nhận mẫu và tách chiết DNA/RNA virus

Thu nhận mẫu

• Ðối với mẫu tôm bố mẹ: lấy gốc chân bơi của cá thể (lượng mẫu không quá 0,3 g) (Hình minh họa).
• Ðối với mẫu tôm hậu ấu trùng (postlarvae): lấy nguyên con, khoảng 50-100 cá thể (lượng mẫu không quá 0,3 g).
• Ðối với mẫu tôm thương phẩm: lấy một phần mang (đã loại bỏ vỏ) hoặc gốc chân bơi (Hình minh họa) của 15-30 cá thể (lượng mẫu không quá 0,3 g).

  

 Tách chiết DNA/RNA virus

Có thể tiến hành tách chiết bằng phương pháp đun (AccuRive Shrimp DNA/ RNA Prep Kit) hoặc tách chiết bằng cột silica (AccuRive Shrimp sDNA/ RNA Prep Kit) để thu nhận DNA/RNA virus. 

• AccuRive Shrimp DNA/RNA Prep Kit

DNA/RNA bộ gene tôm và các phần tử virus có trong mô tôm được thu nhận bằng cách đun trong dung dịch xử lý mô. Quá trình đun sôi kết hợp lắc trộn sẽ tạo sự phá vỡ cơ học lên cấu trúc protein của màng tế bào tôm và vỏ protein của virus. DNA/RNA sau khi được giải phóng sẽ di chuyển vào pha nước và được sử dụng cho phản ứng PCR.

• AccuRive Shrimp sDNA/RNA Prep Kit

Thu nhận bằng phương pháp cột silica: Đầu tiên, guanidine hydrochloride có trong dung dịch ly giải sẽ phá vỡ cấu trúc protein của tế bào và bất hoạt các enzyme phân hủy DNA/RNA có trong hỗn hợp. Sau đó, đưa hỗn hợp ly giải vào cột lọc và dưới sự hỗ trợ của ethanol hoặc isopropanol, DNA/RNA hấp phụ đặc hiệu lên màng silica. Kế tiếp, rửa 2-3 lần màng lọc bằng các dung dịch rửa để làm sạch DNA/RNA đã gắn lên màng. Cuối cùng, DNA/RNA sạch được dung giải khỏi màng nhờ dung dịch bảo quản để ứng dụng cho các phản ứng PCR sau đó.

Phản ứng Onestep Multiplex real-time RT-PCR

   Vùng gen nhân bản

   Hỗn hợp phản ứng PCR chứa hai cặp mồi được thiết kế đặc hiệu cho từng tác nhân mục tiêu WSSV và YHV1. Sản phẩm nhân bản được phát hiện bởi tín hiệu huỳnh quang có được do sự phân cắt các mẫu dò TaqMan đặc hiệu riêng cho từng mục tiêu.

    Ngoài ra, hỗn hợp phản ứng PCR còn chứa một cặp mồi đặc hiệu cho một đoạn mRNA của tôm gọi là chứng nội (Internal Control), có kích thước 99 bp nhằm phát hiện các chất ức chế có trong mẫu và kiểm soát hiệu quả quá trình tách chiết RNA, hiệu quả phiên mã ngược cũng như phản ứng PCR . Sản phẩm nhân bản được phát hiện bởi tín hiệu huỳnh quang có được do sự phân cắt một TaqMan được đánh dấu màu Cy5. 

Phản ứng RT-PCR

   Vì Taq DNA polymerase trong phản ứng PCR không sử dụng RNA làm mạch khuôn cho quá trình nhân bản nên để phản ứng PCR xảy ra, RNA của virus YHV1 cần phải được chuyển thành cDNA thông qua phản ứng phiên mã ngược (RT – Reverse Transcription). 

   Trong phản ứng Onestep RT-PCR, DNA của WSSV và cDNA của YHV1 có được từ phản ứng phiên mã ngược sẽ trực tiếp được sử dụng cho phản ứng PCR. Đầu tiên, nhiệt độ phản ứng được nâng cao làm phân tử DNA mạch đôi tách thành mạch đơn hoặc các phân tử cDNA tách ra khỏi RNA và tồn tại dưới dạng mạch đơn. Ngoài ra, enzyme Taq DNA polymerase lúc này cũng được hoạt hóa. Khi ống phản ứng được làm mát, các đoạn mồi và mẫu dò đến bắt cặp với vùng gen mục tiêu. Nhờ có sự hiện diện của ion Mg2+ và các deoxynucleotide triphosphate (dNTP) ở nồng độ cao, Taq DNA polymerase sẽ kéo dài mồi để tạo nên các phân tử DNA mạch đôi gọi là amplicon. Việc tăng và giảm nhiệt độ của phản ứng được máy luân nhiệt lặp lại theo số chu kỳ đã định trước. 

 Chương trình Onestep Real-time RT-PCR được cài đặt trên máy real-time PCR như sau:

       1 chu kỳ: 50°C – 30 phút

       1 chu kỳ: 95°C – 15 phút

       40 chu kỳ: 95°C – 20 giây

                        60°C – 40 hoặc 60 giây (Đọc tín hiệu FAM, HEX, Cy5)

Phân tích kết quả

Sự có mặt hay vắng mặt của các virus mục tiêu được xác định dựa trên sự có hay không có sản phẩm PCR thông qua việc quan sát tín hiệu huỳnh quang trên thiết bị.

Kiểm tra tín hiệu của các mẫu chứng:

Mẫu chứng âm PCR, chứng âm tách chiết: không có tín hiệu huỳnh quang FAM, HEX, Cy5 nào vượt lên khỏi ngưỡng tín hiệu.

Mẫu chứng dương: đường huỳnh quang FAM, HEX, Cy5 vượt lên khỏi ngưỡng tín hiệu.

Kiểm tra mẫu xét nghiệm: 

Một số lưu ý khi sử dụng

–  Các khu vực trong phòng xét nghiệm cần được tách biệt, tổ chức theo một chiều đi từ khu vực tách chiết DNA/RNA đến khu vực đặt phản ứng PCR. Mỗi khu vực có bộ thiết bị-dụng cụ-hóa chất thao tác riêng.
–  Đọc kỹ hướng dẫn sử dụng trước khi tiến hành thao tác.
–  Mọi mẫu xét nghiệm và vật dụng có liên quan phải được xử lý như vật phẩm có khả năng gây nhiễm.
–  Mang găng tay cho mọi thao tác từ xử lý mẫu cho đến khi đặt phản ứng vào máy. Thay găng tay thường xuyên cho mỗi loại thao tác.
–  Vệ sinh các khu vực thao tác bằng sodium hypochlorite (javel) 0,5 %; chiếu đèn tử ngoại khu vực đặt phản ứng PCR trước và sau khi thao tác 15 phút.
–  Không trộn chung hóa chất từ các lô khác nhau; không sử dụng bộ kit sau khi hết hạn sử dụng.
–  Cần sử dụng đầu tip có phin lọc để tránh làm nhiễm hoá chất và nhiễm chéo mẫu xét nghiệm.
–  Hạn sử dụng của bộ kit là 12 tháng kể từ ngày sản xuất. Lưu ý: Chỉ chuẩn bị hỗn hợp MasterMix đủ cho mỗi đợt xét nghiệm.
–  Không lặp lại quá trình đông lạnh – rã đông quá 5 lần.

    Tóm lại, đó là một số kiến thức cơ bản liên quan về sản phẩm Accupid WYV Detection Kit để phát hiện đồng thời tác nhân gây bệnh đốm trắng và đầu vàng ở tôm.  NKTBIO chúng tôi hy vọng với những kiến thức đã cung cấp, quý bạn đọc sẽ hiểu rõ hơn về nguyên lý hoạt động, cách sử dụng bộ kit cũng như hạn chế sai sót thông qua một số lưu ý khi sử dụng.

Nếu bạn cần thêm thông tin về sản phẩm hoặc cần hỗ trợ tư vấn, bạn có thể liên hệ chúng tôi qua hotline: 028.3636.5898 hoặc gửi mail đến sales1.nktbio@gmail.com để được hỗ trợ nhanh nhất nhé.