Phát hiện CaMV promoter 35S trong thực phẩm bằng kỹ thuật real-time PCR

Thực trạng về thực phẩm biến đổi gen 

Genetically Modified Organism (GMO) trong thực phẩm bao gồm thực vật và động vật đã được áp dụng quá trình biến đổi theo ý muốn của con người thông qua kỹ thuật di truyền. 

Mục đích sử dụng giống biến đổi gen là để tăng khả năng kháng lại sâu bệnh hoặc để cây trồng cứng cáp hơn, bảo quản được lâu hơn. Mặt khác, việc sử dụng thực phẩm biến đổi gen có thể gây dị ứng, gây rối loạn sinh sản ở người, ức chế miễn dịch, kháng kháng sinh hoặc thậm chí gây ung thư…

Diện tích trồng cây GMO ngày càng tăng, phân bố rộng rãi trên toàn thế giới (trong đó đậu nành và bắp là hai loại cây trồng được canh tác lớn nhất). Ngày nay, EU và các nước khác đã thiết lập các khung luật pháp nhằm kiểm soát việc sử dụng và phóng thích các GMO ra môi trường, quan trọng hơn là việc dán nhãn các thực phẩm có chứa các thành phần biến đổi gen. Việc kiểm tra GMO ngày càng được thắt chặt. Ở Việt Nam cũng đã ban hành và thực thi đạo luật về GMO, theo đó sản phẩm có ít nhất một thành phần nguyên liệu biến đổi gen lớn hơn 5% tổng nguyên liệu sẽ được dán nhãn (Thông tư liên tịch 45/2015/ TTLT-BNNPTNT-BKHCN). Phát hiện và sàng lọc GMO là bước đầu để đi đến định lượng.

Promoter 35S từ CaMV là nhân tố điều hòa khởi đầu phiên mã, dùng để biểu hiện gen chuyển, thường được sử dụng trong thực vật biến đổi gen (Genetically modified organism, GMO) được phê duyệt bởi Liên minh châu Âu (EU), thực vật tự nhiên không có trình tự này. CaMV P-35S được sử dụng rộng rãi trong quá trình sàng lọc vật liệu chuyển gen trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và dược phẩm. 

Ứng dụng kỹ thuật real-time PCR để phát hiện thành phần biến đổi gen trong thực phẩm

AccuPid CaMV 35S Promoter Detection Kit của hãng sản xuất Khoa Thương – Việt Nam sử dụng kỹ thuật real-time PCR (qPCR) cho phép phát hiện trình tự DNA chuyển gen bằng cách phát hiện promoter 35S của cauliflower mosaic virus (CaMV) một cách nhanh chóng với độ chính xác và độ nhạy cao, đồng thời giảm thiểu các nguy cơ ngoại nhiễm so với các kỹ thuật PCR khác.

Quy trình xét nghiệm cơ bản được thực hiện với 3 bước như sau:

Bước 1: Chuẩn bị mẫu, tách chiết DNA

Bước 2: Nhân bản vùng trình tự mục tiêu bằng hệ mồi đặc hiệu và thu nhận tín hiệu huỳnh quang bằng thiết bị real-time PCR

Bước 3: Phân tích kết quả

 

Chuẩn bị mẫu, tách chiết DNA

DNA trong mẫu thực phẩm tươi hoặc thực phẩm đã qua chế biến được thu nhận bằng phương pháp tách chiết phù hợp đảm bảo cung cấp đủ lượng DNA với chất lượng phù hợp với phản ứng PCR

DNA tách chiết cần được định lượng bằng phương pháp đo quang phổ ở bước sóng 260nm. Sau đó pha loãng về nồng độ làm việc (40 – 60 ng/μl) để tiến hành thực hiện phản ứng real-time PCR.

Lưu ý: Quy trình tách chiết DNA sẽ đạt hiệu quả tốt khi các mẫu được đồng nhất tốt, mẫu tách chiết nên được xử lý để có dạng bột mịn. Người dùng có thể nghiền mẫu bằng cối chày, các máy xay hoặc các máy đồng nhất thương mại mẫu để tạo dạng bột mịn.

Nhân bản và phát hiện

Phản ứng PCR

Đầu tiên, nhiệt độ phản ứng được nâng cao làm các phân tử DNA bị biến tính thành dạng mạch đơn và hoạt hóa enzyme Taq DNA polymerase. Khi ống phản ứng được làm mát, các đoạn mồi đến bắt cặp với vùng gen mục tiêu. Nhờ có sự hiện diện của ion Mg2+ và các deoxynucleotide triphosphate (dNTP) ở nồng độ cao, Taq DNA polymerase sẽ kéo dài mồi để tạo nên các phân tử DNA mạch đôi gọi là amplicon. Việc tăng và giảm nhiệt độ của phản ứng được máy luân nhiệt lặp lại theo số chu kỳ đã định trước. 

Phát hiện sản phẩm

Với việc sử dụng mẫu dò đánh dấu huỳnh quang (mẫu dò Taqman), sự gia tăng số lượng sản phẩm PCR có thể được theo dõi theo thời gian thực (real-time) bằng cách đo mật độ tín hiệu huỳnh quang phát ra trong suốt quá trình PCR. Khi mẫu dò vẫn còn nguyên vẹn, tín hiệu huỳnh quang phát ra bởi reporter sẽ bị quencher thu hút. Khi phản ứng PCR xảy ra, mẫu dò bắt cặp với vùng gen mục tiêu nằm giữa 2 mồi và bị phân cắt bởi hoạt tính 5’ – 3’ exonuclease của Taq DNA polymerase. Lúc này, phân tử reporter và quencher được tách nhau ra và tín hiệu huỳnh quang thu được từ reporter trở nên mạnh hơn. 

Chương trình real-time PCR như sau:

1 chu kỳ: 95 °C – 15 phút

40 chu kỳ: 95 °C – 20 giây

                  60 °C – 60 giây (Đọc tín hiệu FAM, HEX)

Phân tích kết quả

Sự có mặt hay không của trình tự mục tiêu được xác định dựa trên sự có hay không có sản phẩm PCR thông qua việc quan sát đường biểu diễn huỳnh quang FAM, HEX trên thiết bị.

Tóm lại, kỹ thuật real-time PCR đã hỗ trợ quá trình sàng lọc vật liệu chuyển gen trong thực phẩm trở nên dễ dàng hơn, cho kết quả nhanh chóng và chính xác hơn. Từ đó, việc kiểm soát việc sử dụng và phóng thích các GMO ra môi trường, quan trọng hơn là việc dán nhãn các thực phẩm có chứa các thành phần biến đổi gen thuận lợi hơn.