Phát hiện Clostridium Botulinum trong thực phẩm bằng kỹ thuật real-time PCR (Phần 2)

Bài viết trước chúng tôi đã đề cập đến bộ kit AccuPid Clostridium Botulinum Detection Kit – xét nghiệm để phát hiện vi khuẩn Clostridium Botulinum trong các mẫu thực phẩm. Và hôm nay, NKTBIO sẽ tiếp tục giới thiệu đến quý khách hàng một giải pháp khác giúp phát hiện gen độc tố botulinum type A, B, E, F có trong bộ gen của các chủng vi khuẩn Clostridia có khả năng tiết độc tố botulinum.

AccuPid Clostridium Botulinum Genotyping Kit của hãng sản xuất Khoa Thương – Việt Nam sử dụng kỹ thuật real-time PCR (qPCR) cho phép phát hiện và phân type DNA Clostridium botulinum trong mẫu thực phẩm một cách nhanh chóng với độ chính xác và độ nhạy cao.

AccuPid Clostridium Botulinum Genotyping Kit 

AccuPid Clostridium botulinum Genotyping Kit hoạt động dựa trên việc nhân bản DNA trình tự mục tiêu bằng hệ mồi – mẫu dò đặc hiệu và có thể đọc trực tiếp kết quả dựa trên tín hiệu huỳnh quang thu được mà không cần phải làm thêm bước điện di.
Bộ kit này hoạt động với 4 bước chính: 
–  Bước 1: Chuẩn bị mẫu ( tăng sinh)
–  Bước 2: Tách chiết thu nhận DNA
–  Bước 3: Nhân bản DNA bằng hệ mồi đặc hiệu và thu nhận tín hiệu huỳnh quang bằng thiết bị real-time PCR
–  Bước 4: Phân tích kết quả
Toàn bộ quá trình thực hiện trong khoảng 30 giờ.  

Chuẩn bị mẫu (tăng sinh)

Mẫu thực phẩm xét nghiệm được lấy trong điều kiện vô trùng, dụng cụ lấy và chứa mẫu được khử trùng trước, thao tác thực hiện tránh làm ô nhiễm chéo vi khuẩn từ bên ngoài vào mẫu. Trộn đều các phần trước khi lấy mẫu, lấy đủ lượng mẫu theo quy định.

Bước tăng sinh: 

Cung cấp môi trường và điều kiện nuôi cấy thuận lợi để vi khuẩn Clostridium botulinum tăng sinh lên nhiều lần. Sau khi cân mẫu sẽ bổ sung, một lượng môi trường TPGY lỏng (Trypticase-peptone-glucose- yeast extract) không có oxy hòa tan. Ủ yếm khí ở 28°C, từ 1 – 5 ngày. 

Tách chiết DNA vi khuẩn Clostridium botulinum

DNA vi khuẩn có trong mẫu được thu nhận bằng phương pháp nhiệt (AccuRive Bacteria DNA Prep Kit). Quá trình đun sôi kết hợp lắc trộn sẽ tạo sự phá vỡ cơ học lên cấu trúc protein của màng tế bào và giải phóng DNA. DNA sau khi được giải phóng sẽ di chuyển vào pha nước và được sử dụng cho phản ứng PCR.

Phản ứng real-time PCR

Vùng gen nhân bản

Quy trình real-time PCR sử dụng 4 cặp mồi rtCbot A, rtCbot B, rtCbot E và rtCbot F trong 2 phản ứng (mỗi phản ứng có khả năng phát hiện 2 type) để nhân bản các trình tự mục tiêu đặc hiệu, gồm:

– Một phần đoạn gen BoNT/A hoặc BoNT/E, mã hóa cho các protein độc tố thần kinh botulinum, đặc trưng cho C. botulinum type A hoặc type E. Sự xuất hiện của sản phẩm PCR được phát hiện bằng mẫu dò phát huỳnh quang màu FAM, cho phép kết luận mẫu nhiễm khuẩn Clostridium botulinum type A hoặc type E.

– Một phần đoạn gene BoNT/B hoặc BoNT/F, mã hóa cho các protein độc tố thần kinh botulinum, đặc trưng cho C. botulinum type B hoặc type F. Sự xuất hiện của sản phẩm PCR được phát hiện bằng mẫu dò phát huỳnh quang màu HEX, cho phép kết luận mẫu nhiễm khuẩn Clostridium botulinum type B hoặc type F.

– Một đoạn chứng nội khuyếch đại (Internal Amplification Control – IAC) được thiết kế có chứa vùng trình tự mẫu dò phát huỳnh quang màu CY5, có vai trò kiểm soát hiệu quả quá trình nhân bản của bộ kit.

Nhân bản DNA 

DNA sau khi được tách chiết sẽ được bổ sung vào eppendorf chứa hỗn hợp các thành phần của phản ứng PCR. Tại đây, phản ứng PCR sẽ diễn ra. Đầu tiên, nhiệt độ phản ứng được nâng cao làm các phân tử DNA bị biến tính thành dạng mạch đơn, hoạt hóa enzyme Taq DNA polymerase. Khi ống phản ứng được làm mát, các đoạn mồi đến bắt cặp với vùng gen mục tiêu. Nhờ có sự hiện diện của ion Mg2+ và các deoxynucleotide triphosphate (dNTP) ở nồng độ cao, Taq DNA polymerase sẽ kéo dài mồi để tạo nên các phân tử DNA mạch đôi gọi là amplicon. 

Việc tăng và giảm nhiệt độ của phản ứng được máy luân nhiệt lặp lại theo số chu kỳ đã định trước:  
1 chu kỳ: 95°C – 15 phút
40 chu kỳ: 95°C – 30 giây
                  55°C – 30 giây (Đọc tín hiệu màu FAM, HEX, CY5)
                  72°C – 30 giây

Khi trong mẫu có DNA mục tiêu, phản ứng PCR xảy ra, mẫu dò bắt cặp với vùng gen mục tiêu nằm giữa 2 mồi và bị phân cắt bởi hoạt tính 5’ – 3’ exonuclease của Taq DNA polymerase. Lúc này, phân tử reporter và quencher được tách nhau ra và tín hiệu huỳnh quang thu được từ reporter trở nên mạnh hơn. Sự gia tăng tín hiệu này mạnh hơn sau mỗi chu kỳ và tương ứng với lượng sản phẩm PCR được tạo ra, được biểu diễn bằng đường cong khuếch đại tương ứng.

Thành phần bộ kit

 AccuPid Clostridium botulinum Genotyping Kit cung cấp đầy đủ thành phần hoá chất để thực hiện xét nghiệm định type cho 50 mẫu thực phẩm nhiễm C. botulinum, mỗi mẫu tiến hành PCR với 2 loại mastermix riêng biệt.

Phân tích kết quả

Sự có mặt hay vắng mặt của DNA mục tiêu được xác định dựa trên sự có hay không có sản phẩm PCR thông qua việc quan sát tín hiệu huỳnh quang FAM, HEX, Cy5 trên thiết bị.

Độ nhạy và độ đặc hiệu

– Độ nhạy (LOD50):  
+ Clostridium botulinum type A, B là 10 bản sao/ phản ứng (95% CI); 
+ Clostridium botulinum type E, F là 5 bản sao/ phản ứng (95% CI).
–  Độ chuyên biệt và đặc hiệu: Bộ kit chỉ phát hiện các chủng thuộc loài Clostridium botulinum nhóm I (gene độc tố botulinum type A), nhóm II (gene độc tố botulinum type B), Clostridium baratii (gen độc tố botulinum type E), Clostridium butyricum (gen độc tố botulinum type F) và không phát hiện các loài vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm khác.

Một số lưu ý trong bảo quản và sử dụng kit

Toàn bộ các thành phần của AccuPid Clostridium botulinum Genotyping Kit cần được lưu trữ ở điều kiện nhiệt độ phù hợp theo khuyến cáo của nhà sản xuất để đảm bảo độ nhạy của thử nghiệm cho đến hết thời hạn sử dụng.
–  Hóa chất tách chiết DNA vi khuẩn bảo quản ở nhiệt độ phòng.
–  Hóa chất real-time PCR bảo quản ở nhiệt độ -20°C hoặc lạnh sâu hơn.
–  Không lặp lại quá trình đông lạnh – rã đông quá 5 lần.
–  Hạn sử dụng của bộ kit là 12 tháng kể từ ngày sản xuất. Lưu ý: Chỉ sử dụng phản ứng PCR trong vòng 6 tháng sau khi trộn PrimobeMix vào MasterMix hoặc hút ra eppendorf 0,2 ml.

Sự giống và khác nhau giữa hai bộ kit

Đó là một số thông tin liên quan đến các kit về vi khuẩn Clostridium Botulinum trong thực phẩm mà công ty NKTBIO chúng tôi đang cung cấp. Chúng tôi hy vọng với những thông tin này, quý khách hàng sẽ có thêm nhiều cơ sở cho sự lựa chọn sản phẩm phù hợp với nhu cầu dễ dàng hơn. 

Nếu cần thêm thông tin về sản phẩm hoặc có thắc mắc cần hỗ trợ hãy liên hệ ngay với chúng tôi để được tư vấn sớm nhất:
Công ty TNHH Khoa Học NKTBIO
Văn phòng giao dịch: Số 60, đường số 13, khu dân cư Bình Hưng, Ấp 2, xã Bình Hưng, huyện Bình Chánh, TP.HCM.
Email: info@nktbioco.com
Hotline: 028.3636.5898