Tổng quan về kỹ thuật Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP)

Nếu bạn còn đang thắc mắc về nguyên lý phương pháp loop-mediated isothermal amplification (LAMP): độ nhạy, độ đặc hiệu; thời gian thực hiện và ứng dụng của kỹ thuật này như thế nào thì trong bài viết này, chúng tôi sẽ cung cấp những thông tin hữu ích cũng như liệt kê những câu hỏi thường gặp và gợi ý trả lời như bên dưới.

LAMP là gì?

LAMP là kỹ thuật nhân bản nucleic acid để phát hiện các tác nhân mục tiêu là DNA hoặc RNA. LAMP sử dụng đặc tính thay thế mạch đôi DNA của enzyme DNA polymerase (thường dùng là Bsm DNA polymerase), kết hợp với mồi (primer) được thiết kế riêng biệt để nhân bản đoạn nucleic acid mục tiêu một cách nhanh chóng tại một nhiệt độ nhất định (đẳng nhiệt). LAMP là kỹ thuật lý tưởng cho các thiết bị chẩn đoán tại chỗ (point-of care) hoặc những phòng lab không yêu cầu trang bị những thiết bị chẩn đoán sinh học phân tử phức tạp.

 Những đặc điểm khác nhau giữa LAMP và PCR

• Nhiệt độ để phản ứng thực hiện: PCR yêu cầu chu kỳ luân nhiệt thay đổi theo tính chu kỳ gồm các bước biến tính DNA, gắn mồi và kéo dài để tổng hợp mạch DNA mới. Trong khi, LAMP thực hiện ở nhiệt độ không thay đổi (65°C).
• Sản phẩm nhân bản: Sản phẩm nhân bản PCR là nhiều đoạn amplicon ngắn, riêng lẻ; trong khi sản phẩm của LAMP là những đoạn tiếp nối dài có trình tự được lặp lại giống nhau. LAMP sử dụng 6 primers và  tạo thành một cấu trúc “dumbbell” (cấu trúc DNA có cấu trúc loop gắn 2 đầu của DNA mục tiêu) được nối tiếp với nhau; có chiều dài hơn hàng trăm lần so với DNA mục tiêu đích.
• Thời gian phản ứng: Thời gian thực hiện LAMP vs. PCR tương đối khác biệt. Chu trình chạy PCR thông thường mất khoảng 1.5 giờ; khi khi thời gian thực hiện LAMP khoảng 30-40 phút. 

Tại sao LAMP yêu cầu thiết kế nhiều primers?

Mục đích của LAMP là phát hiện mục tiêu đích càng nhanh càng tốt, và việc thiết kế nhiều primes để quá trình nhân bản nhanh chóng và việc phát hiện tác nhân được rút ngắn. 

LAMP sử dụng 4 primers chính “core” để thực hiện quá trình nhân bản và 2 primers phụ “loop” để xúc tác cho quá trình phản ứng. Các primer chính chứa 2 vùng trình tự đảo ngược và bổ sung lẫn nhau. Trong quá trình phản ứng, các primers này giúp hình thành cấu trúc loop cả 2 đầu cuối của vùng DNA mục tiêu, để hình thành cấu trúc “dumbbell”. Cấu trúc này tạo điều kiện để enzyme DNA polymerase có khả năng thay thế tại các điểm primer (priming point), nhân bản lũy thừa các tác nhân đích một cách nhanh chóng. 

Video 1. Chi tiết nguyên lý kỹ thuật LAMP

Trong khi 4 primers đóng vai trò chính trong LAMP; 2 primer loop còn lại là tùy chọn; chúng có vai trò trong việc tăng tốc phản ứng nhân bản, và giúp phát hiện tín hiệu nhanh bản nhanh chóng hơn, giúp tăng độ nhạy của phản ứng. 

Phương pháp phát hiện tín hiệu trong LAMP

LAMP sử dụng nhiều phương pháp phát hiện tín hiệu nhân bản khác nhau bao gồm: tín hiệu huỳnh quang, quan sát trực tiếp là 2 phương pháp phổ biến. 

• Phát hiện bằng tín hiệu huỳnh quang: LAMP có thể quan sát trong thời gian thực (real-time) hoặc điểm cuối (end-point) sử dụng màu huỳnh quang (fluorescence dye) trên thiết bị đo tín hiệu huỳnh quang (fluorometer); máy real – time PCR; hoặc máy đọc đĩa. Nếu việc đọc kết quả được thực hiện trên máy real-time PCR, chúng ta có thể thực hiện chạy melting-curve để xác định những trình tự không đặc hiệu; điều này rất hữu ích trong các kỹ thuật phát hiện đa tác nhân. 
• Quan sát bằng mắt: LAMP có thể quan sát bằng mắt với phương pháp so màu dựa vào nồng độ pH. Phương pháp này hữu ích trong các xét nghiệm không yêu cầu độ chính xác cao (vì phụ thuộc vào sự quan sát của người đọc kết quả).

Những loại mẫu bệnh phẩm có thể sử dụng và tương tích với LAMP?

LAMP có thể sử dụng đa dạng các loại mẫu khác nhau và thông thường thì ít bị ức chế hơn kỹ thuật PCR. Ngoài các mẫu đầu vào là nucleic acid được tách chiết, các mẫu như nước bọt, lá cây và dung dịch vận chuyển có thể được sử dụng (các mẫu không yêu cầu phải thực hiện tách chiết nucleic acid). 

Có thể sử dụng LAMP thay thế PCR không?

Trong các xét nghiệm chẩn đoán, LAMP cho thời gian trả kết quả nhanh, sử dụng trong các xét nghiệm định tính. Tuy nhiên, nếu xét nghiệm yêu cầu định lượng; giải pháp real – time pCR là lựa chọn tối ưu. Ngoài ra, ưu điểm của LAMP có thể quan sát bằng mắt thường nên ứng dụng trong các thiết bị chẩn đoạn tại chỗ, hoặc thực hiện ngoài phòng Lab với các thiết bị cầm tay.

Ứng dụng của kỹ thuật LAMP

Hiện nay, LAMP đã được biết đến nhiều hơn và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: 

• Lĩnh vực chẩn đoán: LAMP được ứng dụng trong việc vận chuyển mẫu đến phòng lab chuyên sâu tốn kém và xa xôi hay bị hạn chế về thời gian trả kết quả.
• Ngành nông nghiệp: Các virus gây bệnh lý ở thực vật có thể phát tán mầm bệnh sang cây trồng. LAMP được ứng dụng để chẩn đoán các bệnh lý từ mẫu lá cây một cách nhanh chóng và tiết kiệm.
• Khoanh vùng dịch tễ truyền nhiễm: Sử dụng LAMP để chẩn đoán nhanh hơn các bệnh truyền nhiễm nhiệt đới, phát hiện các vector truyền bệnh như bọ chét, muỗi…

Tóm lại, LAMP là công cụ hữu ích phục vụ trong việc nghiên cứu, chẩn đoán hoặc giám sát; ở những nơi mà không phụ thuộc nhiều vào các thiết bị phức tạp; hoặc phòng Lab chuyên sâu nào. 

Nguồn: www.international.neb.com