Phát hiện vi khuẩn Clostridium Botulinum trong thực phẩm bằng kỹ thuật Real-time PCR (Phần 1)

Tiếp tục chuỗi giới thiệu về các sản phẩm kit chẩn đoán bệnh thì tuần này NKTBIO SCIENCE muốn giới thiệu đến bạn đọc một bộ kit phát hiện vi khuẩn gây “ngộ độc thịt” – Clostridium botulinum trong thực phẩm. Vi khuẩn Clostridium botulinum là gì? Tác hại của chúng từ đâu mà có và bộ kit phát hiện chúng trong thực phẩm được thực hiện theo nguyên lý nào?, Cách tiến hành ra sao?…Các bạn hãy tham khảo bài viết dưới đây của chúng tôi nhé!

Đầu tiên, NKTBIO sẽ giới thiệu một chút về vi khuẩn Clostridium botulinum. 

 Giới thiệu về Clostridium botulinum

Clostridium botulinum (C.botulinum) là vi khuẩn gram dương yếm khí, hình que, hai đầu tròn, có nhiều lông quanh thân, di động. Chúng có khả năng sinh bào tử và sinh độc tố thần kinh botulism. C.botulinum phân bố rộng rãi trong tự nhiên, có thể tìm thấy trong đất vườn, nước ao, ruột gia súc đặc biệt phát triển mạnh trong thức ăn ôi thiu, thịt hộp để qua ngày. 

Thức ăn đóng hộp, đóng gói, phơi sấy để lâu, đồ dưa muối đóng hộp lâu được xem là môi trường yếm khí thuận lợi cho bào tử sinh trưởng, trở thành vi khuẩn C. botulinum và tiết ra độc tố botulism gây bệnh ‘ngộ độc thịt’ cực kỳ nguy hiểm. Người bị ngộ độc sẽ nôn ói, đau bụng, bụng chướng, thường táo bón vì liệt ruột, liệt hành tủy và cơ vận động lan từ trên xuống, liệt cơ hô hấp làm suy hô hấp, và thậm chí độc tố này có thể gây chết người tức thời với 1 liều lượng độc tố cực nhỏ. Do đó, các chỉ tiêu về vệ sinh an toàn thực phẩm của các nước trên thế giới đều không cho phép xuất hiện bất kỳ tế bào C. botulinum nào trong 25g thực phẩm.

 AccuPid Clostridium botulinum Detection Kit 

AccuPid Clostridium botulinum Detection Kit sử dụng kỹ thuật real-time PCR (qPCR) cho phép phát hiện DNA của vi khuẩn Clostridium botulinum trong mẫu thực phẩm một cách nhanh chóng với độ chính xác và độ nhạy cao, đồng thời giảm thiểu các nguy cơ ngoại nhiễm so với các kỹ thuật PCR khác.

 Nguyên lý hoạt động

AccuPid Clostridium botulinum Detection Kit hoạt động dựa trên việc nhân bản đoạn trình tự mục tiêu bằng hệ mồi – mẫu dò đặc hiệu và có thể đọc trực tiếp kết quả dựa trên tín hiệu huỳnh quang thu được.

Quy trình xét nghiệm vi khuẩn Clostridium botulinum trong mẫu thực phẩm hoạt động dựa trên bốn bước chính: 
Bước 1: Chuẩn bị mẫu (bước tăng sinh)
Bước 2: Tách chiết DNA
Bước 3: Nhân bản DNA Clostridium botulinum bằng hệ mồi đặc hiệu và thu nhận tín hiệu huỳnh quang bằng thiết bị real-time PCR
Bước 4: Phân tích kết quả. 

Toàn bộ quy trình thực hiện trong khoảng 30 giờ.

Chuẩn bị mẫu (tăng sinh)

Mẫu thực phẩm xét nghiệm phải được lấy trong điều kiện vô trùng, dụng cụ lấy và chứa mẫu phải được khử trùng trước, thao tác thực hiện tránh làm ô nhiễm chéo vi khuẩn từ bên ngoài vào mẫu. Trộn đều các phần trước khi lấy mẫu, lấy đủ lượng mẫu theo quy định.

Tăng sinh: Sau khi cân mẫu thực phẩm, sẽ cung cấp môi trường TPGY lỏng (Trypticase-peptone-glucose-yeast extract) không có oxy hòa tan, ủ yếm khí ở 28°C, từ 1 – 5 ngày để tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của Clostridium botulinum nhằm gia tăng số lượng của chúng trong mẫu lên nhiều lần.

Tách chiết DNA

DNA của vi khuẩn Clostridium botulinum được tách chiết từ dịch tăng sinh bằng phương pháp nhiệt (có thể sử dụng kit tách chiết  AccuRive Bacteria DNA Prep Kit (EX-DNA04.1A) của hãng Khoa Thương). DNA vi khuẩn có trong mẫu được thu nhận bằng phương pháp nhiệt. Quá trình đun sôi kết hợp lắc trộn sẽ tạo sự phá vỡ cơ học lên cấu trúc protein của màng tế bào và giải phóng DNA. DNA sau khi được giải phóng sẽ di chuyển vào pha nước và được sử dụng cho phản ứng PCR.

Phản ứng real-time PCR

DNA sau khi được tách chiết sẽ được bổ sung vào tube PCR chứa hỗn hợp các thành phần của phản ứng PCR. Hỗn hợp phản ứng PCR chứa một cặp mồi nhân bản vùng bảo tồn của gen nontoxin- nonhemagglutinin (ntnh) hiện diện ở tất cả các chủng C. botulinum. Sản phẩm nhân bản được phát hiện bởi tín hiệu huỳnh quang có được do sự phân cắt mẫu dò TaqMan đánh dấu màu FAM đặc hiệu cho C. botulinum. Và một “chứng nội kiểm soát sự nhân bản” (Internal Amplification Control – IAC) là đoạn DNA nhân tạo để phát hiện các chất ức chế có trong mẫu và kiểm soát hiệu quả nhân bản của phản ứng PCR, được thiết kế có chứa vùng trình tự mẫu dò phát huỳnh quang màu HEX. 

Đầu tiên, nhiệt độ phản ứng được nâng cao làm các phân tử DNA bị biến tính thành dạng mạch đơn. Ngoài ra, enzyme Taq DNA polymerase lúc này cũng được hoạt hóa. Khi ống phản ứng được làm mát, các đoạn mồi đến bắt cặp với vùng gen mục tiêu. Nhờ có sự hiện diện của ion Mg2+ và các deoxynucleotide triphosphate (dNTP) ở nồng độ cao, Taq DNA polymerase sẽ kéo dài mồi để tạo nên các phân tử DNA mạch đôi gọi là amplicon. Việc tăng và giảm nhiệt độ của phản ứng được máy luân nhiệt lặp lại theo số chu kỳ đã định trước. Hiện tượng nhân bản chỉ xảy ra ở vùng gen mục tiêu chứ không xảy ra trên toàn bộ bộ gen.

Khi trong mẫu có DNA mục tiêu, phản ứng PCR xảy ra, mẫu dò bắt cặp với vùng gen mục tiêu nằm giữa 2 mồi và bị phân cắt bởi hoạt tính 5’ – 3’ exonuclease của Taq DNA polymerase. Lúc này, phân tử reporter và quencher được tách nhau ra và tín hiệu huỳnh quang thu được từ reporter trở nên mạnh hơn.

Phân tích kết quả

Sự có mặt hay vắng mặt của DNA mục tiêu được xác định dựa trên sự có hay không có sản phẩm PCR thông qua việc quan sát tín hiệu huỳnh quang FAM, HEX trên thiết bị.

Độ nhạy, độ đặc hiệu của kit

AccuPid Clostridium botulinum Detection Kit có khả năng phát hiện phát hiện mẫu DNA bộ gene của vi khuẩn Clostridium botulinum với độ chính xác và độ đặc hiệu cao. Bộ kit này chỉ phát hiện các chủng thuộc loài Clostridium botulinum và có giới hạn phát hiện (LOD50): 14 bản sao/phản ứng.

Một số điểm cần lưu ý về bảo quản kit

–  Hạn sử dụng của bộ kit là 12 tháng kể từ ngày sản xuất nhưng chỉ sử dụng phản ứng PCR trong vòng 6 tháng sau khi trộn PrimobeMix vào MasterMix hoặc hút ra tube PCR.
–  Tất cả các thành phần của bộ kit sẽ được bảo quản ở nhiệt độ -20 °C hoặc lạnh sâu hơn. Vì vậy, khi sử dụng cần rã đông nhưng không được lặp lại quá trình đông lạnh – rã đông quá 5 lần, làm ảnh hưởng đến tác dụng của hóa chất.
–  Không để hóa chất tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng mặt trời.
Đó là toàn bộ những thông tin liên quan về bộ kit AccuPid Clostridium botulinum Detection Kit. Hy vọng với những thông tin mà NKTBIO cung cấp này, các bạn sẽ hiểu rõ hơn cách thức hoạt động của bộ kit và sử dụng hiệu quả hơn nhất.

Hẹn các bạn ở Phần 2 để cùng theo dõi về một bộ kit khác phát hiện vi khuẩn Clostridium botulinum trong thực phẩm nhé. 

Nếu có nhu cầu về sản phẩm hoặc cần được hỗ trợ tư vấn thêm thì bạn có thể liên hệ nhanh với chúng tôi:
Công ty TNHH Khoa học NKTBIO
Văn phòng giao dịch: số 60, đường số 13, Khu Dân cư Bình Hưng, Ấp 2, xã Bình Hưng, Bình Chánh, TP.HCM
Hotline: 028.3636.5898
Email: info@nktbioco.com