Mục đích sử dụng thuốc nhuộm tham chiếu ROX trong kỹ thuật Real-Time PCR

Thuốc nhuộm ROX là gì?

ROX là thuốc nhuộm huỳnh quang xem như là một thành phần trong hỗn hợp phản ứng (master mix) Real-time PCR. Không giống như các thuốc nhuộm SYBR™ Green hoặc FAM™; thuốc nhuộm ROX không gây ảnh hưởng đến sản phẩm nhân bản PCR. Tuy nhiên, tín hiệu huỳnh quang màu ROX dễ bị nhiễu bởi các yếu tố như:

• Bọt khí trong giếng phản ứng
• Bốc hơi dung dịch
• Ngưng tụ dung dịch
• Các vấn đề khác về thiết bị (xung điện không ổn định,…)

Do đó, ROX được xem là thuốc nhuộm tham chiếu (reference dye) để chuẩn hóa tín hiệu huỳnh quang trong việc phân tích kết quả Real-Time PCR. Để tính toán giá trị chuẩn hóa (Rn), tín hiệu huỳnh quang cần phân tích được chia cho tín hiệu thuốc nhuộm tham chiếu. Miễn là giá trị tỷ lệ (ratio) này được giữ cố định, sử dụng ROX giúp phát hiện được những yếu tố gây ảnh hưởng đến kết quả phân tích. Ví dụ, Biểu đồ nhân bản (hình 1A) không sử dụng màu ROX tham chiếu, bạn có thể quan sát các bọt khí trong giếng ảnh hưởng đến việc đọc kết quả huỳnh quang; trong khi biểu đồ nhân bản (hình 1B) có sử dụng màu ROX để chuẩn hóa tín hiệu huỳnh quang, giúp loại bỏ tín hiệu nhiễu (gây ra bởi bọt khí).

Tại sao sử dụng thuốc nhuộm ROX trong Real-Time PCR?

Thuốc nhuộm ROX giúp tăng độ chính xác trong các lần lặp lại xét nghiệm 

Trong xét nghiệm Real-time PCR, sự sai lệch kết quả tín hiệu huỳnh quang giữa các giếng trong cùng một lần chạy thường xảy ra phổ biến. Vì thế, sử dụng thuốc nhuộm tham chiếu thụ động ROX giúp chuẩn hóa tín hiệu huỳnh quang trong quá trình phân tích kết quả; từ đó gia tăng độ chính xác giữa các lần chạy lặp lại. Ngoài ra, dữ liệu kết quả có sử dụng ROX trong Real-Time PCR giúp tăng độ chính xác hơn kết quả không sử dụng; giúp người thực hiện chạy ít bước lặp lại hơn, tốn ít thời gian và tài nguyên (Hình 2).

Thuốc nhuộm ROX giải quyết một số lỗi thông thường trong Real-time PCR

Sử dụng thuốc nhuộm ROX trong Real-Time PCR giúp phát hiện những lỗi đơn giản, có thể gây ra bởi người thực hiện.Ví dụ như: việc quên bổ sung DNA/RNA nguyên mẫu (template) vào phản ứng; không trộn đều hỗn hợp master mix; đậy nắp PCR không kín,…. Vì vậy, người thực hiện cần đánh giá độ cong/hình dạng đường tín hiệu huỳnh quang ROX trên biểu đồ kết quả, giúp kiểm soát một số lỗi trong quá trình thực hiện (Hình 3):

• Đường tín hiệu màu ROX nằm ngang trong suốt quá trình phản ứng: đây là kết quả được mong đợi. Tín hiệu ROX được giữ ổn định vì nó không bị ảnh hưởng bởi quá trình nhân bản.
• Đường tín hiệu màu ROX có xu hướng đi lên: đây là kết quả có thể xảy ra do hiện tượng bay hơi hỗn hợp phản ứng. 
• Đường tín hiệu màu ROX  tăng hoặc giảm đột biến: đây là kết quả có thể xảy ra do bọt khí trong tube PCR hoặc dòng điện cung cấp không ổn định.

 Nguồn: www.thermofisher.com