Tách chiết Nucleic Acid trong 30 giây (Phần 2)

Trong bài viết phần này, chúng tôi giới thiệu chi tiết phương pháp tách chiết Nucleic Acid trong 30 giây. 

Giấy lọc Whatman No.1 có thể tách chiết và tinh sạch DNA sau khi thực hiện bước rửa

Chúng tôi kiểm tra tính hiệu quả của giấy lọc Whatman No.1 có thể bắt và giữ DNA trong thời gian ngắn (khoảng 1 phút) trước khi được rửa sạch và đưa vào hỗn hợp master mix PCR. Phân tích kết quả thu được khi so sánh với phương pháp thêm DNA trực tiếp vào hỗn hợp master mix, cho thấy kết quả nhân bản tương đương nhau (Hình 1A). Dựa vào kết quả so sánh trên, màng cellulose có khả năng thu giữ DNA hiệu quả mà không có bất kỳ ức chế phản ứng nhân bản PCR. 

Sau đó, chúng tôi thử nghiệm phương pháp tách chiết này trên mẫu lá A. thaliana để kiểm tra khả năng loại bỏ các chất hóa học/sinh học ức chế PCR trong quá trình tách chiết tế bào thực vật, mà vẫn giữ lại nồng độ DNA đủ cho phản ứng PCR (Hình 1B). Màng lọc Whatman No.1 7 mm2 ( đường kính 3mm ) được thêm vào tube chứa dung dịch tách chiết trong vòng 1 phút, sau đó chuyển màng lọc này vào tube chứa dung dịch rửa và cuối cùng nhúng vào tube chứa hỗn hợp phản ứng PCR. Kết quả thu được như sau (hình 1C):

• Mẫu với màng lọc Whatman No.1 không qua bước rửa: cho kết quả âm tính (không có sản phẩm nhân bản)
• Mẫu với màng lọc được rửa 1 lần: cho kết quả dương tính. Điều này giải thích tính hiệu quả thu hồi DNA, khi thực hiện bước rửa với dung dịch rửa làm sạch các chất ức chế phản ứng PCR.
• Mẫu với màng lọc được rửa 2 lần: cho kết quả dương tính. Tuy nhiên, kết quả không có sự khác biệt so với màng lọc được rửa 1 lần. 

Khả năng bắt giữ và giải phóng DNA

Nucleic acid có thể kết dính nhanh chóng với các sợi cellulose nhưng khả năng giải phóng của chúng lại chậm. Đáng chú ý, các thành phần khác có trong dung dịch mẫu tách chiết bao gồm: các chất ức chế phản ứng,.. không có khả năng bám dính vào cellulose hoặc được rửa trôi nhanh chóng qua những bước rửa. Kết quả chúng tôi thu được, DNA kết dính với màng lọc Whatman No.1 và nhanh chóng đạt trạng thái cân bằng với dung dịch xung quanh. Trong hình 2A & 2B biểu diễn kết quả thời gian ủ càng lâu không cải thiện khả năng nhân bản sản phẩm; ngược lại trong quá trình rửa, lượng DNA giải phóng khỏi màng lọc cellulose rất chậm.

Tách chiết Nucleic Acid không sử dụng pipet

Dựa trên những kết quả thực nghiệm trong nghiên cứu này, nhằm mục đích đơn giản hóa quá trình tách chiết Nucleic Acid, chúng tôi sử dụng que thử có phủ lớp cellulose để thao tác được dễ dàng và giảm thiểu các bước chuyển màng lọc cellulose giữa các tubes. Chúng tôi chọn thiết kế que thử làm từ màng Whatman No.1 với kích thước 8 mm2 là bề mặt để DNA bám dính và thanh chống thấm dài được tẩm giấy lọc bằng sáp paraplast (Hình 3A). Với cải tiến sử dụng que thử có phủ lớp cellulose thay cho màng lọc cellulose như đề cập ở trên, chúng tôi sử dụng các thuốc thử được chuẩn bị trước và có thể lưu trữ ở nhiệt độ phòng trong thời gian dài. Khi sử dụng, quá trình tách chiết Nucleic Acid sẽ được thực hiện một các nhanh chóng qua 3 bước thực hiện và thời gian trong 30 giây mà không cần sử dụng pipet hay bất kỳ thiết bị nào khác (Hình 3B). 

Video 1. https://youtu.be/J7DbKMrZh40

Nguồn tham khảo: Zou Y et al (2017) Nucleic acid purification from plants, animals and microbes in under 30 seconds. PLoS Biol 15(11).