Phát hiện vi khuẩn Mycoplasma bovis trong mẫu bệnh phẩm bò bằng kỹ thuật real-time PCR

Vi khuẩn Mycoplasma bovis và sự ảnh hưởng đến gia súc

Mycoplasma bovis (M.bovis) là một trong 126 loài thuộc chi Mycoplasma, là tế bào sống và sinh vật kỵ khí nhỏ nhất trong tự nhiên. Vi khuẩn này chủ yếu ảnh hưởng đến gia súc và ít ảnh hưởng đến các vật nuôi sản xuất khác. Nó không ảnh hưởng đến ngựa và hoặc thú cưng, nhưng những động vật khác có thể là vật mang mầm bệnh cho Mycoplasma bovis.

Mycoplasma bovis là nguyên nhân gây viêm phế quản phổi, viêm vú và viêm khớp nhưng cũng có thể ảnh hưởng đến các cơ quan chính khác của gia súc như mắt, tai hoặc não. Mặc dù, có đặc điểm không lây truyền từ động vật sang người, nhưng nhiễm M. bovis là nguyên nhân gây ra các vấn đề về sức khỏe và phúc lợi kinh tế đáng kể trên toàn thế giới. M. bovis đã lây lan trên toàn thế giới, bao gồm cả những quốc gia được coi là không có mầm bệnh trong một thời gian dài. 

Ứng dụng kỹ thuật real-time PCR để phát hiện Mycoplasma bovis trong mẫu bệnh phẩm bò

Kỹ thuật real-time PCR với độ nhạy, độ đặc hiệu cao cho phép phát hiện DNA M. bovis được thu nhận từ các loại mẫu sinh phẩm ở bò một cách nhanh chóng và chính xác đồng thời giảm thiểu các nguy cơ ngoại nhiễm so với các kỹ thuật PCR khác.

AccuPid M. bovis Detection Kit của hãng sản xuất Khoa Thương – Việt Nam sử dụng kỹ thuật real-time PCR cho phép phát hiện sự hiện diện của DNA Mycoplasma bovis trong các mẫu sữa, mẫu phết sinh dục, mắt mũi, họng, mô bệnh của bò cần xét nghiệm.

Kit hoạt động dựa trên việc nhân bản đoạn trình tự mục tiêu bằng hệ mồi – mẫu dò đặc hiệu và có thể đọc trực tiếp kết quả dựa trên tín hiệu huỳnh quang thu được.

Quy trình xét nghiệm vi khuẩn M. bovis trong mẫu thú y hoạt động dựa trên ba bước chính:

Bước 1: Chuẩn bị mẫu và tách chiết DNA;

Bước 2: Nhân bản DNA M. bovis bằng hệ mồi đặc hiệu và thu nhận tín hiệu huỳnh quang bằng thiết bị real-time PCR; 

Bước 3: Phân tích kết quả. 

Toàn bộ quy trình thực hiện trong khoảng 3-4 giờ.

Chuẩn bị mẫu và tách chiết DNA

Các mẫu cần được chuẩn bị và tách chiết DNA với phương pháp thích hợp để cung cấp được DNA đáp ứng đủ số lượng và chất lượng cho phản ứng real-time PCR.

DNA trong mẫu bệnh phẩm cần được tách chiết và tinh sạch nhằm loại bỏ các chất gây ức chế phản ứng PCR. Các phương pháp tách chiết DNA thường bao gồm bước biến tính protein; cố định DNA và rửa trôi các chất ức chế; và thu nhận DNA tinh sạch. Các chất gây biến tính protein sẽ phá vỡ cấu trúc các protein trên tế bào vi khuẩn…từ đó làm vỡ tế bào và giải phóng DNA bộ gen. Sau đó, DNA được giữ lại trên các giá thể phù hợp và loại bỏ chất gây ức chế bằng các dung dịch rửa giải. Cuối cùng, DNA tinh sạch được thu hồi bằng cách hòa tan DNA trong dung dịch bảo quản.

Phản ứng real-time PCR

DNA sau khi được tách chiết sẽ được bổ sung vào tube PCR chứa hỗn hợp các thành phần của phản ứng PCR. Tại đây, phản ứng PCR sẽ diễn ra. Đầu tiên, nhiệt độ phản ứng được nâng cao làm các phân tử DNA bị biến tính thành dạng mạch đơn. Ngoài ra, enzyme Taq DNA polymerase lúc này cũng được hoạt hóa. Khi ống phản ứng được làm mát, các đoạn mồi đến bắt cặp với vùng gene mục tiêu. Nhờ có sự hiện diện của ion Mg2+ và các deoxynucleotide triphosphate (dNTP) ở nồng độ cao, Taq DNA polymerase sẽ kéo dài mồi để tạo nên các phân tử DNA mạch đôi gọi là amplicon. Việc tăng và giảm nhiệt độ của phản ứng được máy luân nhiệt lặp lại theo số chu kỳ đã định trước.

Phân tích kết quả

Sự có mặt hay vắng mặt của DNA mục tiêu được xác định dựa trên sự có hay không có sản phẩm PCR thông qua việc quan sát tín hiệu huỳnh quang trên thiết bị phân tích.

Tóm lại, tuy vi khuẩn Mycoplasma bovis không lây truyền từ động vật sang người nhưng việc kiểm soát nhiễm trùng M. bovis bị cản trở do thiếu vắc-xin và phương pháp điều trị hiệu quả do xu hướng kháng thuốc kháng sinh ngày càng tăng. Do đó, việc xét nghiệm nhanh chóng và chính xác M. bovis là rất quan trọng, từ đó giúp cho công tác phòng ngừa, tiêu hủy và cách ly kịp thời, hiệu quả.

Nguồn: Tổng hợp