Ngăn ngừa dương tính giả và âm tính giả trong PCR

PCR là một kỹ thuật có độ nhạy cao đòi hỏi sự cẩn thận và kiểm soát thích hợp để ĐẢM BẢO KẾT QUẢ CHÍNH XÁC.

Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) và phiên mã ngược PCR (RT-PCR) mang lại độ nhạy cực cao, do đó, phù hợp làm xét nghiệm chẩn đoán mầm bệnh vi rút và vi khuẩn, cũng như ứng dụng cho các xét nghiệm di truyền. Tuy nhiên, do độ nhạy cao của kỹ thuật này, có nguy cơ dẫn đến kết quả dương tính giả (phát hiện được các trình tự không nhắm mục tiêu) và kết quả âm tính giả (không phát hiện được các trình tự nhắm mục tiêu). Tuy nhiên, có nhiều cách để giảm nguy cơ dương tính giả và âm tính giả nhằm đảm bảo kết quả chính xác hơn.

Dương tính giả

Các yếu tố gây dương tính giả

• Do quá trình vận chuyển, xử lý hay thu gom mẫu không cẩn thận gây nhiễm.
• Do có một lượng quá lớn tác nhân gây bệnh hiện diện trong mẫu bệnh phẩm dẫn đến dễ gây nhiễm sang các mẫu khác gây nên dương tính giả.
• Môi trường phòng thí nghiệm bị nhiễm các trình tự đã khuếch đại trước đó, sau đó khi thao tác không cẩn thận dẫn đến gây nhiễm cho mẫu bệnh phẩm

Phòng ngừa

• Phải có chứng âm để đảm bảo không có axit nucleic gây nhiễm nào được đưa vào hỗn hợp chính. Chứng âm khi cho kết quả âm tính cho thấy không có sự nhiễm nào xảy ra.
• Tách biệt các khu vực riêng của phòng thí nghiệm cho các công đoạn như tách chiết, khuếch đại, pha hóa chất, đặt phản ứng. Đồng thời thực hiện quy trình làm việc chỉ theo một chiều.
• Duy trì không gian làm việc sạch sẽ và làm sạch tất cả các bề mặt trong khu vực PCR bằng cồn 70%.
• Chiếu xạ tia cực tím (UV) có thể được sử dụng để khử nhiễm axit nucleic gây ô nhiễm…
• Các phương pháp sử dụng enzym, bao gồm cả việc sử dụng Uracil-DNA glycosylase (UNG), có hiệu quả để kiểm soát nhiễm bẩn. UNG sẽ phân huỷ các sản phẩm ngoại nhiễm của lần PCR trước, chỉ để lại các mẫu axit nucleic tự nhiên để khuếch đại.
• Thực hiện vệ sinh định kỳ và giám sát phạm vi rộng, bao gồm thực hiện PCR trên tất cả thuốc thử và tăm bông tại nơi làm việc..
• Tuân thủ các kỹ thuật lấy mẫu và xử lý thích hợp, chẳng hạn như đeo găng tay, sử dụng dụng cụ và bình thu thập vô trùng (tránh chạm vào bên trong) và duy trì nhiệt độ thích hợp trong suốt quá trình vận chuyển…

Âm tính giả

Các yếu tố gây âm tính giả

• Thu thập/vận chuyển mẫu không đúng cách..
• Axit nucleic bị phân hủy trong quá trình vận chuyển hoặc lưu trữ.. Thời gian thu thập mẫu bệnh không thích hợp.
• Sai sót trong quá trình tách chiết DNA/RNA.
• Sự hiện diện của các chất ức chế trong việc khuếch đại DNA/RNA của mẫu bệnh sẽ gây cản trở ở các bước khác nhau trong suốt quá trình phân tích PCR. Sự ức chế là nguyên nhân hàng đầu gây ra các lỗi trong xét nghiệm, vì chất ức chế có thể tương tác trực tiếp với DNA/RNA hoặc ngăn chặn hoạt động của polymerase..
• Các chất ức chế được tìm thấy trong các mẫu máu, huyết thanh hoặc huyết tương: immunoglobulin G (IgG), hemoglobin, lactoferrin, chất chống đông máu như heparin, hormone và các chất kháng vi-rút như như acyclovir..
• Chất ức chế tìm thấy trong mẫu nước tiểu: urê.
• Các chất ức chế được tìm thấy trong phân và mẫu phân: polysacarit, chất diệp lục, muối mật, urê, glycolipid, huyết sắc tố và heparin…

Phòng ngừa

–  Sử dụng các chứng nội, bao gồm chứng nội nội sinh. Những gen này xuất hiện trong mẫu vật (ví dụ β-actin là trình tự bộ gen của vật chủ)..

–  Sử dụng mẫu đối chứng với chứng nội ngoại sinh. Chúng có độ tương đồng với mầm bệnh ta đang thực hiện, bao gồm một khuôn mẫu với mồi nhân tạo và các vị trí liên kết mồi giống như trình tự của mầm bệnh đích, hoặc dị loại, được thiết kế với các mồi và đầu dò có tính đặc hiệu cao.

–  Loại bỏ các chất ức chế:

• Sử dụng các phương pháp xử lý mẫu và tách chiết axit nucleic thích hợp..
• Chọn một DNA polymerase thích hợp để giảm nguy cơ chất ức chế làm suy yếu hoạt động của enzyme polymerase.
• Urê có thể được loại bỏ khỏi mẫu nước tiểu bằng lọc máu hoặc siêu lọc

Nguồn: AirCleanSystem & Promega