Kỹ thuật Real-time PCR trong chẩn đoán bệnh ở thú cưng

Real time PCR là gì?

Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại phân tử DNA đích được hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng. Kết quả khuếch đại được quan sát thông qua các tín hiệu huỳnh quang được giải phóng trong quá trình phản ứng PCR xảy ra. Để có được những đặc điểm như vậy, hệ thống real-time PCR phải được tích hợp các đầu dò để phát hiện các tín hiệu huỳnh quang trong quá trình phân tích. Và các tín hiệu này được phát hiện và ghi lại dưới dạng biểu đồ, từ đó có thể đưa ra đánh giá về số lượng sản phẩm khuếch đại DNA đích có mặt ở mỗi chu kỳ. Real-time PCR có 3 chức năng cơ bản đó là phát hiện sự hiện diện các trình tự DNA đích trong mẫu, định lượng các bản sao của trình tự DNA đích và phân tích đường cong nóng chảy hay nhiệt độ nóng chảy. 

Thành phần Real time PCR

Về cơ bản real-time PCR có đầy đủ các thành phần tham gia phản ứng của PCR như mồi, DNA khuôn mẫu, dNTPs, Taq polymerase… và bổ sung một số thành phần khác như probe hay chất nhuộm huỳnh quang. Bên cạnh đó mồi được sử dụng trong real-time PCR cần thiết kế để đảm bảo phản ứng khuếch đại sản phẩm đặc hiệu và tối ưu nhất. 

Đánh dấu huỳnh quang trong Real time PCR

Hiện nay có nhiều phương pháp hóa học cơ bản được sử dụng để đánh dấu huỳnh quang trong kỹ thuật real-time PCR và chúng có độ nhạy tương đối giống nhau. Các phương pháp này đều sử dụng công nghệ đánh dấu huỳnh quang, kết hợp với các bước nhân bản, phát hiện sản phẩm PCR mục tiêu nhằm kiểm tra hàm lượng sản phẩm PCR cần quan tâm trong thời gian thật (real-time) của quá trình PCR. Phương pháp đơn giản nhất là sử dụng một chất hóa học phát huỳnh quang gắn một cách đặc hiệu vào phân tử DNA mạch đôi. Các phương pháp còn lại sử dụng các mẫu dò có đánh dấu huỳnh quang lai đặc hiệu với sản phẩm PCR cần nhân bản. 

Ứng dụng trong chẩn đoán bệnh ở thú cưng

Real-time PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng phổ biến trong việc chẩn đoán bệnh nhiễm trên người, trên thú y, bệnh nhiễm thủy sản và cả trong an toàn thực phẩm,… Trong lĩnh vực thú cưng, Real-time PCR được sử dụng để phát hiện nhanh chóng tác nhân gây bệnh như vi khuẩn, virus, ký sinh trùng gây bệnh trên chó, mèo,…. 

Real time PCR có thể phát hiện sớm các bệnh trên chó, mèo như: 

• Tác nhân Babesia canis gây bệnh lê dạng trùng (Babesiosis) ở chó/mèo.
• Tác nhân Toxoplasma gondii gây bệnh nhiễm ký sinh trùng Toxoplasma (Toxoplasmosis) ở chó/mèo. 
• Tác nhân Mycoplasma gây bệnh ký sinh trùng máu ở chó/mèo.
• Tác nhân Anaplasma gây bệnh ký sinh trùng máu, do ve cắn ở chó/mèo.
• Tác nhân Giardia lamblia gây bệnh nhiễm trùng ruột non ở chó/mèo.
• Tác nhân Ehrlichia canis gây bệnh ehrlichiosis (bệnh giảm bạch cầu) ở chó. 
• Tác nhân Virus Parvo gây bệnh Parvo ở chó/mèo.
• Tác nhân virus Canine distemper (CDV) ở chó.
• Tác nhân virus Adeno Tuýp 1 và Tuýp 2 gây bệnh viêm gan truyền nhiễm ở chó. 
•  Tác nhân Coronavirus một trong những nguyên nhân gây ra bệnh viêm phúc mạc ở mèo.

Với ưu thế về thời gian, độ nhạy và độ chính xác cao, phương pháp Real-time PCR được sử dụng tại các cơ quan thú y của nhà nước, các trung tâm xét nghiệm, phòng khám bệnh viện thú y để chẩn đoán, phát hiện sớm bệnh và phục vụ điều trị cho thú cưng.