Kỹ thuật multiplex real-time PCR và ứng dụng

Khái niệm 

Multiplex real-time PCR là kỹ thuật nhân bản một hoặc nhiều trình tự DNA trong cùng một phản ứng PCR, nhiều trình tự sẽ được nhân bản sử dụng nhiều cặp mồi và các thành phần master mix. Phương pháp này được xem là một phương pháp cải tiến của PCR thông thường, có độ nhạy cao, thời gian thực hiện ngắn và phát hiện được nhiều tác nhân gây bệnh chỉ trong một phản ứng. 

Ưu điểm 

• Thu được nhiều dữ liệu từ một mẫu xét nghiệm
• Tăng cường công suất xét nghiệm
• Chuẩn hóa dữ liệu biểu hiện gen chính xác hơn
• Giảm số lần thao tác tay và thời gian
• Tiết kiệm chi phí

Thực hiện kỹ thuật Multiplex Real-time PCR

Về cơ bản, kỹ thuật multiplex Real-time PCR điển hình không khác biệt so với kỹ thuật đơn Real-time PCR.

Chọn chất phát tín hiệu huỳnh quang

Thuốc nhuộm SYBR Green

Màu huỳnh quang chèn vào sợi đôi DNA là một loại màu huỳnh quang có ái lực rất cao khi có sự hiện diện của sợi đôi DNA và ái lực này là do khả năng chèn của màu vào giữa sợi đôi DNA và làm cho sợi đôi DNA phát được ánh sáng huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích. 

Sử dụng probe làm chất phát huỳnh quang

Taqman probes là đầu dò đánh dấu kép có thể bị thủy phân, sử dụng hoạt tính 5’ exonuclease của Taq polymerase để xác định số lượng trình tự đích. Đầu dò (probe) Taqman là oligonucleotide dài 18-22 base, đánh đánh dấu chất phát huỳnh quang ở đầu 5 và chất hấp thụ chất phát quang (quencher) ở đầu 3’. Khi chưa có sự xuất hiện của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích thì Taqman probe vẫn còn nguyên vẹn do vậy mà huỳnh quang phát ra được từ reporter ở đầu 5’ sẽ bị quencher ở đầu 3’ của probe hấp phụ, ống thử nghiệm sẽ không phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích. Khi bắt đầu có sự xuất hiện sản phẩm nhân bản đặc hiệu thì Taqman probe sẽ bắt cặp vào sợi khuôn của sản phẩm này ở giai đoạn nhiệt độ bắt cặp và sẽ bị enzyme Taq polymerase cắt bỏ để kéo dài mồi tổng hợp nên sợi bổ sung, do vậy mà reporter của Taqman probe sẽ bị cắt rời xa quencher và phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích. Càng nhiều sản phẩm nhân bản xuất hiện thì số lượng reporter tự do sẽ càng nhiều, đến một lúc nào đó cường độ huỳnh quang phát ra từ reporter đủ mạnh thì máy sẽ ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận được nguồn sáng kích thích. 

Tối ưu hóa chọn mồi 

Thiết kế mồi đặc hiệu là một trong những yếu tố quyết định đến sự thành công của phản ứng multiplex Real time PCR. Các lưu ý quan trọng khi thiết kế mồi cho phản ứng này được liệt kê bên dưới. Đây có thể coi là chìa khóa quyết định sự chính xác của quá trình nhân bản các trình tự DNA với hàm lượng sản phẩm cao nhất.

 Chiều dài mồi

Phản ứng multiplex Real time PCR chứa nhiều cặp mồi khác nhau, vì vậy, các mồi được thiết kế phải có chiều dài thích hợp. Thông thường các mồi có chiều dài khoảng từ 18 đến 22 nucleotide.

 Nhiệt độ nóng chảy của mồi (Tm)

Mồi nên có nhiệt độ nóng chảy tương đương nhau, tốt nhất là nằm trong khoảng từ 55°C – 60°C. Với những trình tự có tỷ lệ GC cao, Tm của mồi có thể cao hơn (khoảng 75°C – 80°C). Độ dao động về Tm giữa các mồi nên nằm trong khoảng 3°- 5°C.

Độ đặc hiệu

Độ đặc hiệu là vấn đề cần được quan tâm hàng đầu trong quá trình thiết kế mồi. Với phản ứng multiplex PCR càng trở nên quan trọng, đặc biệt là trong các phản ứng có xảy ra cạnh tranh về mồi và DNA khuôn mẫu.

Tránh hình thành dimer primer

Các mồi được thiết kế nên tránh hình thành hiện tượng dimer. Dimer primer (hiện tượng mồi bắt cặp với nhau) có thể dẫn đến việc nhân bản không đặc hiệu.

Ứng dụng 

Multiplex real-time PCR có nhiều ứng dụng rộng rãi, có thế xác định sự có mặt cùng lúc nhiều tác nhân khác nhau như virus, vi khuẩn và các tác nhân xâm nhiễm khác. Đồng thời, kỹ thuật này cũng được dùng để xác định các thành phần có trong một hỗn hợp mẫu hoặc cũng có thể dùng để xác định sự có mặt của nhiều gen đơn lẻ trong hệ gen.

Kỹ thuật multiplex real-time PCR được sử dụng vào các mục đích:

• Xác định tác nhân gây bệnh
• Hiệu suất SNP genotyping cao
• Phát hiện đột biến
• Phát hiện đột biến mất trong gen
• Định lượng mẫu
• Phân tích các liên kết
• Phát hiện RNA
• Nghiên cứu pháp y

Nguồn: tổng hợp