Bệnh sốt xuất huyết do virus Dengue và phát hiện bệnh bằng kỹ thuật Real-time PCR

Bệnh sốt xuất huyết là bệnh phổ biến ở nước ta do virus Dengue (dengue hemorrhagic fever, DHF hay Sốt dengue ) gây ra. Bệnh xảy ra quanh năm và thường bùng phát vào mùa mưa, thời điểm thuận lợi để muỗi vằn sinh sôi và bùng phát dịch sốt xuất huyết Dengue. 

Chuẩn bị những hiểu biết về bệnh sốt xuất huyết do virus Dengue gây ra; triệu chứng, biểu hiện và các phát hiện bệnh…. sẽ được chúng tôi đề cập trong bài viết lần này. Hãy tham khảo bài viết bên dưới đây nhé! 

Bệnh sốt xuất huyết do virus Dengue

Virus Dengue là một thành viên của họ Flaviviridae, chi Flavivirus. Virus có cấu trúc hình khối đa diện đường kính 35-50 nm. Vỏ ngoài virus là lớp lipid kép chứa chứa glycoprotein và protein có nguồn gốc từ màng sinh chất của tế bào. Vỏ capsid bao quanh acid nucleic tạo thành nucleocapsid có đường kính 30nm, chứa 32 capsome. Virus Dengue có kháng nguyên kết hợp bổ thể, trung hòa và ngăn ngưng kết hồng cầu. Dựa vào sự khác biệt giữa các điểm quyết định kháng nguyên, người ta chia virus Dengue ra làm 4 type khác nhau bao gồm DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4. 

Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO), khoảng 40% dân số thế giới có nguy cơ bị nhiễm virus dengue, và xuất hiện ở hơn 100 quốc gia như châu Phi, châu Mỹ, Đông Địa Trung Hải, Đông Nam Á, Tây Thái Bình Dương. Trong đó, Mỹ, Đông Nam Á và Tây Thái Bình Dương bị ảnh hưởng nghiêm trọng nhất. Ở Việt Nam, bệnh có xu hướng theo mùa, tập trung vào những tháng 7-8 đến tháng 11-12 ở miền Bắc và xảy ra quanh năm ở miền Nam.

Bệnh sốt xuất huyết Dengue có biểu hiện đa dạng, diễn biến nhanh chóng từ nhẹ đến nặng và rất dễ nhầm lẫn. Biểu hiện sốt xuất huyết khác nhau từ vào mức độ của bệnh. 

Dấu hiệu sốt xuất huyết nhẹ: Triệu chứng bao gồm như sốt và kéo dài 4-7 ngày tính từ khi bị nhiễm bệnh. Ngoài ra, các triệu chứng cảnh báo sớm khác: sốt cao 40,5 độ C; đau đầu nghiêm trọng; đau phía sau mắt; đau khớp và cơ; buồn nôn và ói mửa; phát ban. 

Dấu hiệu sốt xuất huyết nặng: Triệu chứng bao gồm các triệu chứng trên kèm theo tổn thương ở mạch máu và mạch bạch huyết, chảy máu cam, chảy máu ở dưới da, gây ra vết bầm tím. 

Giải pháp phát hiện bệnh bằng kỹ thuật Real-time PCR

AccuPid Dengue Detection Kit của hãng sản xuất Khoa Thương được sử dụng trong xét nghiệm phát hiện virus Dengue gây sốt xuất huyết từ mẫu huyết thanh nghi ngờ bị nhiễm virus này. 

Quy trình thực hiện gồm 4 bước cơ bản như:

Bước 1: Chuẩn bị mẫu (huyết thanh)

Bước 2: Tách chiết RNA

Bước 3: Phản ứng phiên mã ngược từ RNA thành cDNA 

Bước 4: Nhân bản vùng trình tự mục tiêu bằng hệ mồi đặc hiệu và thu nhận tín hiệu huỳnh quang bằng thiết bị real-time PCR.

Bước 5: Phân tích kết quả

Quá trình có thể hoàn tất trong khoảng 3 – 4 giờ.

Chuẩn bị mẫu

Mẫu huyết thanh

Tách chiết RNA

RNA trong mẫu bệnh phẩm được tách chiết và tinh sạch nhằm loại bỏ các chất gây ức chế phản ứng PCR. Các phương pháp tách chiết RNA thường bao gồm bước biến tính protein; cố định RNA và rửa trôi các chất ức chế; và thu nhận RNA tinh sạch. Các chất gây biến tính protein sẽ phá vỡ cấu trúc các protein trên tế bào người và vi khuẩn, virus, nấm,…từ đó làm vỡ tế bào và giải phóng RNA bộ gen. Sau đó, RNA được giữ lại trên các giá thể phù hợp và loại bỏ chất gây ức chế bằng các dung dịch rửa giải. Cuối cùng, RNA tinh sạch được thu hồi bằng cách hòa tan RNA trong dung dịch bảo quản.

Nhân bản và phát hiện

Phản ứng RT (Reverse transcription)

Trong phản ứng này, các đoạn DNA ngắn dài 6 nucleotide bắt cặp ngẫu nhiên trên RNA bộ gene của virus Dengue và mRNA của người. Enzyme reverse transcriptase sử dụng các đoạn DNA này như mồi cho quá trình tạo các mạch DNA bổ sung (complement DNA – cDNA) với RNA. 

Phản ứng Real time RT-PCR

cDNA có được từ phản ứng phiên mã ngược sẽ được trực tiếp sử dụng cho phản ứng PCR. Đầu tiên, nhiệt độ phản ứng được nâng cao làm các phân tử DNA bị biến tính thành dạng mạch đơn và hoạt hóa enzyme Taq DNA polymerase. Khi ống phản ứng được làm mát, các đoạn mồi đến bắt cặp với vùng gen mục tiêu. Nhờ có sự hiện diện của ion Mg2+ và các deoxynucleotide triphosphate (dNTP) ở nồng độ cao, Taq DNA polymerase sẽ kéo dài mồi để tạo nên các phân tử DNA mạch đôi gọi là amplicon. Việc tăng và giảm nhiệt độ của phản ứng được máy luân nhiệt lặp lại theo số chu kỳ đã định trước. 

Phát hiện sản phẩm

Với việc sử dụng mẫu dò đánh dấu huỳnh quang (mẫu dò Taqman), sự gia tăng số lượng sản phẩm PCR có thể được theo dõi theo thời gian thực (real-time) bằng cách đo mật độ tín hiệu huỳnh quang phát ra trong suốt quá trình PCR. Khi mẫu dò vẫn còn nguyên vẹn, tín hiệu huỳnh quang phát ra bởi reporter sẽ bị quencher thu hút. Khi phản ứng PCR xảy ra, mẫu dò bắt cặp với vùng gen mục tiêu nằm giữa 2 mồi và bị phân cắt bởi hoạt tính 5’ – 3’ exonuclease của Taq DNA polymerase. Lúc này, phân tử reporter và quencher được tách nhau ra và tín hiệu huỳnh quang thu được từ reporter trở nên mạnh hơn. 

Phân tích kết quả

Sự có mặt hay vắng mặt của RNA mục tiêu được xác định dựa trên sự có hay không có sản phẩm PCR thông qua việc quan sát tín hiệu huỳnh quang trên thiết bị.

Tóm lại, việc chẩn đoán bệnh sốt xuất huyết có thể gặp nhiều khó khăn, bởi vì các dấu hiệu của bệnh có thể dễ nhầm lẫn với những bệnh lý khác cũng có triệu chứng tương tự. Vì vậy, nếu nghi ngờ mắc phải sốt xuất huyết Dengue, bệnh nhân cần đến y tế chuyên khoa để khám, xét nghiệm và điều trị kịp thời; tránh những biến chứng nguy hiểm có thể xảy ra. 

Nguồn: Tổng hợp