Virus viêm gan C (HCV) và định lượng HCV bằng kỹ thuật onestep real-time RT-PCR

Virus viêm gan C

Virus viêm gan C (Hepatitis C Virus – HCV) là một trong những tác nhân chính gây viêm gan siêu vi ở người. Chúng được phát hiện vào năm 1989, lây truyền qua đường máu như virus viêm gan B, nhưng hiếm khi lây qua đường tình dục. 

Viêm gan C thường được gọi là một “bệnh thầm lặng” vì nhiều bệnh nhân mang virus thường không có triệu chứng và không cảm thấy bệnh. Tuy nhiên, khoảng 85% số người nhiễm chuyển sang tình trạng mạn tính với nhiều hậu quả như xơ gan, mất chức năng gan hoặc ung thư tế bào gan. 

Kỹ thuật Onestep real-time RT-PCR  

Hiện nay, có rất nhiều giải pháp để phát hiện bệnh như xét nghiệm miễn dịch, giải pháp sinh học phân tử… Tuy nhiên, các xét nghiệm miễn dịch chỉ cho phép phát hiện phần lớn trường hợp nhiễm mạn tính HCV, hoàn toàn không hiệu quả trong giai đoạn “cửa sổ”.  Trong khi đó, các kỹ thuật phân tử, đặc biệt là các kỹ thuật nhân bản vật liệu di truyền với độ nhạy và độ đặc hiệu cao cho phép định bệnh sớm và chính xác trước khi kháng thể kháng HCV xuất hiện trong máu, rất cần thiết cho bệnh nhân bị tiêu giảm miễn dịch (immunosuppressed). 

Kỹ thuật real-time PCR cho phép xác định chính xác hàm lượng virus trong máu, hay xác định tuýp HCV nhiễm, phục vụ hữu hiệu cho việc tiên lượng bệnh, chỉ định và theo dõi điều trị.

 AccuPid HCV Quantification Kit của hãng sản xuất Khoa Thương là một xét nghiệm định lượng RNA của virus viêm gan C trong huyết thanh, huyết tương (ống EDTA) người, hoạt động dựa trên việc nhân bản đoạn trình tự mục tiêu bằng hệ mồi – mẫu dò đặc hiệu bằng kỹ thuật onestep real-time RT-PCR. 

Quy trình xét nghiệm định lượng virus viêm gan C trong mẫu bệnh phẩm hoạt động dựa trên hai bước chính: 

B1: Xử lý mẫu huyết thanh để thu được RNA của virus

B2: Chuyển RNA thành cDNA đồng thời nhân bản cDNA HCV bằng cặp mồi đặc hiệu và định lượng sản phẩm nhân bản dựa trên tín hiệu huỳnh quang thu được. 

Quy trình thực hiện trong khoảng 3 – 3,5 giờ.

Xử lý mẫu

Mẫu máu toàn phần được ly tâm phân đoạn để thu lấy huyết thanh, huyết tương. RNA bộ gene của các phần tử virus HCV có trong mẫu có thể được thu nhận bằng nhiều phương pháp tách chiết như tách chiết bằng cột silica, tách chiết tự động, tủa phenol-chloroform…  

Phản ứng Onestep RT-PCR

• Tổng hợp cDNA (phản ứng RT) 

Vì Taq DNA polymerase trong phản ứng PCR không sử dụng RNA làm mạch khuôn cho quá trình nhân bản nên để phản ứng PCR xảy ra, RNA của HCV cần phải được chuyển thành cDNA thông qua phản ứng phiên mã ngược và cDNA trực tiếp được sử dụng cho phản ứng PCR.

• Nhân bản (phản ứng real-time PCR)

Đầu tiên, nhiệt độ phản ứng được nâng cao làm các phân tử cDNA tách ra khỏi RNA và tồn tại dưới dạng mạch đơn, hoạt hóa enzyme Taq DNA polymerase. Khi ống phản ứng được làm mát, các đoạn mồi và mẫu dò đến bắt cặp với vùng gen mục tiêu. Nhờ có sự hiện diện của ion Mg2+ và các deoxynucleotide triphosphate (dNTP) ở nồng độ cao, Taq DNA polymerase sẽ kéo dài mồi để tạo nên các phân tử DNA mạch đôi gọi là amplicon. Việc tăng và giảm nhiệt độ của phản ứng được máy luân nhiệt lặp lại theo số chu kỳ đã định trước. 

Với việc sử dụng mẫu dò đánh dấu huỳnh quang (mẫu dò TaqMan), sự gia tăng số lượng sản phẩm PCR có thể được theo dõi theo thời gian thực (real-time) bằng cách đo mật độ tín hiệu huỳnh quang phát ra trong suốt quá trình PCR. Sự gia tăng tín hiệu này mạnh hơn sau mỗi chu kỳ và tương ứng với lượng sản phẩm PCR được tạo ra.

• Phân tích kết quả

Phân tích kết quả trên phần mềm máy tính. 

Sự có mặt hay vắng mặt của RNA mục tiêu được xác định dựa trên sự có hay không có sản phẩm PCR thông qua việc quan sát tín hiệu huỳnh quang trên thiết bị.

Kết quả định lượng mẫu dương tính với RNA HCV (copies/ml) được tính bằng cách nhân giá trị “hàm lượng DNA HBV trong một phản ứng PCR” với hệ số nhân.

–  “Hàm lượng RNA HCV trong một phản ứng PCR” được tính dựa trên đường chuẩn xây dựng từ các nồng độ Chứng dương đã biết.

–  Hệ số nhân được tính theo công thức và  tùy vào loại kit tách chiết sử dụng

Tóm lại, xét nghiệm real-time PCR là một giải pháp thiết thực và hiệu quả trong chẩn đoán và điều trị HCV. Nhiễm virus viêm gan C thường không có triệu chứng nhưng có thể dẫn đến nhiều hậu quả mạn tính đáng lo ngại như xơ gan, ung thư gan nên cần chủ động thực hiện các xét nghiệm để phòng ngừa cũng như phát hiện sớm và điều trị kịp thời.

Nếu cần hỗ trợ, tư vấn hoặc có nhu cầu mua sản phẩm hãy liên hệ ngay với chúng tôi:
Công ty TNHH Khoa học NKTBIO
VPGD: Số 60, đường số 13, Khu Dân cư Bình Hưng, Ấp 2, xã Bình Hưng, huyện Bình Chánh, TPHCM.
Hotline: 028.3636.5898
Email: info@nktbioco.com