Bệnh ho gà và ứng dụng kỹ thuật Real-time PCR trong phát hiện bệnh

Ho gà là bệnh lây nhiễm phổ biến ở mọi lứa tuổi nhưng gây biến chứng nguy hiểm nhất là trẻ sơ sinh và trẻ em dưới 2 tuổi. Việc phát hiện và điều trị sớm tránh biến chứng và phòng tránh bệnh hiệu quả. 

Chuẩn bị những hiểu biết về bệnh ho gà; triệu chứng, biểu hiện và cách phát hiện bệnh…. sẽ được chúng tôi đề cập trong bài viết lần này. Hãy tham khảo bài viết bên dưới đây nhé! 

Bệnh ho gà

Tác nhân gây bệnh ho gà là vi khuẩn có tên khoa học Bordetella pertussis thuộc giống Bordetella. Loại vi khuẩn này là dạng trực khuẩn hai đầu nhỏ, thuộc loại vi khuẩn có kích thước nhỏ nhất, không di động, gram (-). Vi khuẩn phát triển tốt trên môi trường Bordet-Gengou có thạch máu với những khuẩn lạc điển hình. Vi khuẩn có sức đề kháng rất yếu, thường bị chết trong 1 giờ dưới tác dụng của nhiệt độ, ánh sáng mặt trời trực tiếp hoặc thuốc sát khuẩn thông thường.

Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hàng năm trên thế giới có khoảng 30-50 triệu người mắc ho gà, trong số đó có khoảng hơn 300.000 người tử vong, tỷ lệ này tăng cao nhất ở nhóm trẻ nhỏ. Từ khi có vắc xin phòng ngừa, tỷ lệ mắc cũng như tử vong do bệnh này gây ra đã giảm. Ở Việt Nam, theo kết quả giám sát năm 2015, có 88,4% số ca mắc bệnh không được tiêm vắc xin, 6,6% số ca chỉ được tiêm 1 mũi vắc xin. Trẻ càng nhỏ tuổi bệnh diễn biến càng nặng và có nguy cơ mắc các biến chứng nguy hiểm. Trẻ khi sinh ra từ các bà mẹ không có kháng thể phòng bệnh có nguy cơ mắc bệnh cao hơn so với trẻ nhận được kháng thể từ mẹ.

Bệnh thường bắt đầu bằng các triệu chứng gần giống như cảm lạnh, ho ít hoặc sốt nhẹ. Sau 1-2 tuần bắt đầu ho nhiều hơn. Các cơn ho gà xảy ra liên tục trong nhiều tuần. Cơn ho có thể dữ dội, ho nhanh, nhiều, cho tới khi khí ra khỏi phổi, người bệnh phải cố gắng hít vào gắng sức tạo tiếng rít lớn. Tình trạng ho này có thể khiến người bệnh nôn khan, mệt mỏi.

Các triệu chứng sớm dễ nhận biết bệnh ho gà trong 1-2 tuần thường là:

• Chảy nước mũi
• Sốt nhẹ (thường nhẹ trong suốt quá trình bệnh
• Ho nhẹ hoặc thúng thắng
• Ngừng thở – tạm ngừng hô hấp (ở trẻ sơ sinh)

Giải pháp phát hiện bệnh bằng kỹ thuật Real-time PCR

Accupid Bordetella 3 Detection Kit của hãng sản xuất Khoa Thương, được sử dụng trong xét nghiệm phát hiện vi khuẩn Bordetella pertussis (BP), Bordetella parapertussis (BPP), Bordetella holmesii (BH) gây bệnh ho gà áp dụng trên các nền mẫu từ các bệnh phẩm dịch tiết hô hấp (dịch phết tỵ hầu, dịch phết mũi hầu, dịch phế quản phế nang, phết tai mũi họng, mẫu đàm, dịch nội khí quản, dịch màng phổi,…). Xét nghiệm này định tính dựa trên kỹ thuật real-time PCR sử dụng mẫu dò Taqman cho phép phát hiện nhanh và chính xác vi khuẩn Bordetella pertussis (BP), Bordetella parapertussis (BPP), Bordetella holmesii (BH) gây bệnh ho gà trong các mẫu bệnh phẩm. Kit có ưu điểm là dễ thực hiện, độ đặc hiệu, độ nhạy cao; có chứng nội ngoại sinh và các đối chứng khác để kiểm soát khả năng dương tính giả, âm tính giả.

Quy trình thực hiện gồm 4 bước cơ bản như:

Bước 1: Chuẩn bị mẫu  (dịch tiết hô hấp) 

Bước 2: Tách chiết DNA

Bước 3: Nhân bản vùng trình tự mục tiêu bằng hệ mồi đặc hiệu và thu nhận tín hiệu huỳnh quang bằng thiết bị real-time PCR.

Bước 4: Phân tích kết quả

Quá trình có thể hoàn tất trong khoảng 3 – 4 giờ.

Chuẩn bị mẫu

Dịch tiết hô hấp: dịch phết tỵ hầu, dịch phết mũi hầu, dịch phế quản phế nang, phết tai mũi họng, mẫu đàm, dịch nội khí quản, dịch màng phổi,…

Tách chiết DNA

DNA trong mẫu bệnh phẩm được tách chiết và tinh sạch nhằm loại bỏ các chất gây ức chế phản ứng PCR. Các phương pháp tách chiết DNA thường bao gồm bước biến tính protein; cố định DNA và rửa trôi các chất ức chế; và thu nhận DNA tinh sạch. Các chất gây biến tính protein sẽ phá vỡ cấu trúc các protein trên tế bào người và vi khuẩn, virus, nấm,…từ đó làm vỡ tế bào và giải phóng DNA bộ gen. Sau đó, DNA được giữ lại trên các giá thể phù hợp và loại bỏ chất gây ức chế bằng các dung dịch rửa giải. Cuối cùng, DNA tinh sạch được thu hồi bằng cách hòa tan DNA trong dung dịch bảo quản.

Nhân bản và phát hiện

Phản ứng PCR

Đầu tiên, nhiệt độ phản ứng được nâng cao làm các phân tử DNA bị biến tính thành dạng mạch đơn và hoạt hóa enzyme Taq DNA polymerase. Khi ống phản ứng được làm mát, các đoạn mồi đến bắt cặp với vùng gen mục tiêu. Nhờ có sự hiện diện của ion Mg2+ và các deoxynucleotide triphosphate (dNTP) ở nồng độ cao, Taq DNA polymerase sẽ kéo dài mồi để tạo nên các phân tử DNA mạch đôi gọi là amplicon. Việc tăng và giảm nhiệt độ của phản ứng được máy luân nhiệt lặp lại theo số chu kỳ đã định trước. 

Phát hiện sản phẩm

Với việc sử dụng mẫu dò đánh dấu huỳnh quang (mẫu dò Taqman), sự gia tăng số lượng sản phẩm PCR có thể được theo dõi theo thời gian thực (real-time) bằng cách đo mật độ tín hiệu huỳnh quang phát ra trong suốt quá trình PCR. Khi mẫu dò vẫn còn nguyên vẹn, tín hiệu huỳnh quang phát ra bởi reporter sẽ bị quencher thu hút. Khi phản ứng PCR xảy ra, mẫu dò bắt cặp với vùng gen mục tiêu nằm giữa 2 mồi và bị phân cắt bởi hoạt tính 5’ – 3’ exonuclease của Taq DNA polymerase. Lúc này, phân tử reporter và quencher được tách nhau ra và tín hiệu huỳnh quang thu được từ reporter trở nên mạnh hơn. 

Phân tích kết quả

Sự có mặt hay vắng mặt của DNA mục tiêu được xác định dựa trên sự có hay không có sản phẩm PCR thông qua việc quan sát tín hiệu huỳnh quang trên thiết bị.

Tóm lại, bệnh ho gà là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm với nhiều biến chứng nặng đặc biệt bệnh ho gà ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ. Bệnh cần được phát hiện sớm điều trị sớm tránh những biến chứng nặng của bệnh.

Nguồn: Tổng hợp